[发明专利]一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法

说明书

技术领域    

本发明涉及细胞体外诱导培养及扩增技术领域，特别涉及一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法。

背景技术   

肿瘤过继免疫治疗是指通过向肿瘤患者输注抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应以达到杀伤肿瘤细胞治疗肿瘤的目的，过继免疫治疗是肿瘤生物治疗的重要组成部分，在肿瘤的治疗中起着积极的作用，其中常见的细胞种类包括细胞因子诱导的T细胞（cytokine induced killor, CIK细胞）、自然杀伤细胞（Nature killor, NK细胞）和杀伤性T细胞（cytotoxic T cell，CTL）。其中CTL是机体特异性抗肿瘤免疫的主要效应细胞，是肿瘤免疫治疗中较为理想的效应细胞种类。CTL是一类具有CD3+CD8+表面标志、具有MHC I限制性的T细胞，可以特异性地快速性杀伤靶细胞。虽然CTL受MHC I类分子限制性，T细胞过继免疫疗法须使用患者自身的血液进行，但HLA与患者相同或部分相同的健康个体也可获得特异性的CTL。近年来的研究成果肯定了来自患者体内或经体外肿瘤抗原刺激的肿瘤抗原特异性T细胞过继免疫疗法，但该方法仍有不足之处：患者在疾病状态下免疫细胞功能低下，而且经连续放化疗之后，使体外扩增难度进一步增加。因此寻找功能健全的免疫细胞来源非常必要。

脐带血干细胞是目前的研究热点，其来源丰富，获取方便，含有丰富的造血干细胞和免疫细胞；同时脐血造血干细胞具有多向分化潜能，在造血因子的作用下可以分化扩增。目前技术已能长时间储存脐血，经深低温长期储存的脐血经过多种细胞因子组合诱导分化，可产生大量免疫细胞如CIK细胞和NK细胞，用于肿瘤过继免疫治疗，但有关扩展脐血CTL的报道尚不多见。

虽然很多研究结果显示脐血特异性的CTL的杀伤活性较成人外周血CTL低，但脐血T细胞前体和辅助T细胞前体的含量与成人外周血相当，受异种抗原刺激的增殖反应强，仍然可作为过继免疫治疗的来源。如脐血T淋巴细胞分泌IFN-γ低于成人，但在IL-2刺激后，两者无明显差异。经PHA-P刺激后能够使脐血T淋巴细胞活化，有文献报道，脐血淋巴细胞对不同浓度的植物血凝集素(PHA)和刀豆蛋白A的增殖反应与成人相同或高于成人 ，所以脐血T淋巴细胞可望成为肿瘤过继免疫治疗的主要替代细胞来源。

发明内容   

为了解决以上现有技术中本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种MHC限制性杀伤T细胞（CTL，表型为CD₃+CD₈+）的体外诱导培养方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法，包括以下步骤：

（1）分离脐带血单个核细胞；

（2）脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10% FBS的RPMI-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用，

第一阶段为第1天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的GM-CSF, 10-100ng/mL的γ-IFN,  10-100ng/mL的IL-15, 1-5ug/mL的PHA-P和10-1000IU/mL的IL-4进行培养；

第二阶段为第2天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF,10-100ng/mL的FLT-3L,  10-100ng/mL的anti-CD3, 10-100ng/mL的anti-CD28和100-1000IU/mL的IL-2进行培养；

第三阶段为第5-8天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF, 10-100ng/mL的FLT-3L, 10-100ng/mL的IL-15和100-1000IU/mL的IL-2进行培养；

第四阶段为第9-15天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的IL-15和100-1000IU/mL的IL-2进行培养。

一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法，包括以下步骤：

（1）分离脐带血单个核细胞；

（2）脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10% FBS的RPMI-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用，

第一阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的GM-CSF, 10-100ng/mL的γ-IFN,5-50ng/mL的IL-15, 1-5ug/mL的PHA-P和10-500IU/mL的IL-4进行培养；