[发明专利]一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法

权利要求书

1.一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法，其特征是包括以下步骤：

（1）分离脐带血单个核细胞；

（2）脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10% FBS的RPMI-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用，

第一阶段为第1天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的GM-CSF, 10-100ng/mL的γ-IFN,  10-100ng/mL的IL-15, 1-5ug/mL的PHA-P和10-1000IU/mL的IL-4进行培养；

第二阶段为第2天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF,10-100ng/mL的FLT-3L,  10-100ng/mL的anti-CD3, 10-100ng/mL的anti-CD28和100-1000IU/mL的IL-2进行培养；

第三阶段为第5-8天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的SCF, 10-100ng/mL的FLT-3L, 10-100ng/mL的IL-15和100-1000IU/mL的IL-2进行培养；

第四阶段为第9-15天，在基础培养基中加入10-100ng/mL的IL-15和100-1000IU/mL的IL-2进行培养。

2.一种MHC限制性杀伤T细胞的体外诱导培养方法，其特征是包括以下步骤：

（1）分离脐带血单个核细胞；

（2）脐带血单个核细胞放入培养基中培养，采用含10% FBS的RPMI-1640为基础培养基，添加不同的细胞因子在培养细胞的4个阶段使用，

第一阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的GM-CSF, 10-100ng/mL的γ-IFN,5-50ng/mL的IL-15, 1-5ug/mL的PHA-P和10-500IU/mL的IL-4进行培养；

第二阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的SCF,10-50ng/mL的FLT-3L,10-100ng/mL的anti-CD3,10-100ng/mL的anti-CD28和1000-2000IU/mL的IL-2进行培养；

第三阶段在基础培养基中加入10-50ng/mL的SCF, 10-50ng/mL的FLT-3L, 5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2进行培养；

第四阶段在基础培养基中加入5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2进行培养。

3.根据权利要求2所述的体外诱导培养方法，其特征在于

第一阶段在基础培养基中加入20ng/mL的GM-CSF, 50ng/mL的γ-IFN,10ng/mL的IL-15, 2ug/mL的PHA-P和100IU/mL的IL-4进行培养；

第二阶段在基础培养基中加入20ng/mL的SCF,20ng/mL的FLT-3L,50ng/mL的anti-CD3,50ng/mL的anti-CD28和1000IU/mL的IL-2进行培养；

第三阶段在基础培养基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L, 10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2进行培养；

第四阶段在基础培养基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2进行培养。

4.根据权利要求1或2所述的体外诱导培养方法，其特征在于在每个阶段中保持细胞密度为5×10⁶个/mL。

5.根据权利要求1或2或4所述的体外诱导培养方法，其特征在于培养发生在37℃、5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱内。

6.根据权利要求1或2或4所述的体外诱导培养方法，其特征在于分离脐带血单个核细胞的步骤包括：脐带血用淋巴细胞分离液分离，用密度梯度离心法分离得到脐带血单个核细胞。