[发明专利]籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及种子检测技术领域，特别是指一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法。

背景技术

籼粳杂交稻是利用水稻籼粳杂交集聚亚种间有利基因选育综合性状优良的强优势杂交水稻组合，是我国杂交水稻育种研究的战略重点，将在稳定我省粮食总量，保障口粮安全，促进农民增产增收发挥重要作用。

籼粳交水稻种子中含有大量淀粉（65%-70%）、蛋白质（7%-9%）及脂肪（2%-3%），这些物质的存在很大程度上影响了种子内直接提取的DNA的质量。现在传统的做法是将种子进行标准发芽，等幼苗长到一定大小后在幼苗叶片中提取种子的DNA，这种方法大大延长了DNA提取的周期，从而降低了室内分子标记鉴定种子纯度快速高效性。

种子真实性和纯度是杂交水稻种子质量的核心指标，是种子质量分级的主要标准，是企业购销种子的关键依据，优良品种种子混杂，纯度降低将阻碍品种优良遗传性能的充分发挥，导致作物产量和质量的明显降低，不仅对生产、销售产生巨大影响，还将给国家、政府、农民造成重大损失。随着作物选育品种数目的增多及育种材料遗传基础的日益狭窄，使得品种间的遗传差异越来越小，导致品种真实性和纯度鉴定的难度不断加大。因此，建立一套简便、快捷、经济、准确的品种真实性和纯度鉴定技术体系是保护育种者的知识产权、打击假冒伪劣种子、规范种子市场和促进我国种子产业参与国际竞争的迫切需要。DNA分子标记反映了DNA水平上生物个体间的遗传差异，具有数量丰富、多态性高、不受环境影响、检测快速等优点而逐渐得到应用(李召华等，2006)。其中，SSR(simple sequence repeat)标记因为多态性好、重复性高、操作简便，被认为是一种发展前景看好的DNA指纹技术。SSR分子标记是由Moore等于1989年创建的一种基于特异引物PCR技术的分子标记(Moore等，1991)，属于共显性标记，具有多态性丰富，操作简单，重复性好等优点，检测结果准确可靠，重复性好，操作简便、快速，且对DNA数量及质量要求不高，广泛应用于遗传图谱构建、比较基因组研究、遗传多样性分析和种质鉴定等方面，是目前最受欢迎的DNA指纹图谱技术之一。SSR分子标记技术在杂交水稻种子纯度鉴定中的应用，已小范围应用于种子纯度检测实践(李召华等，2006)。彭锁堂等(2003)用引物RM17对杂交稻组合汕优63和两优培九进行了SSR鉴定；Nandakumar等(2004)利用SSR分子标记成功构建4个水稻品种及其亲本的指纹图谱，并成功用于品种的纯度鉴定。肖小余等(2006)从208对引物中筛选出具有多态性的引物123对，建立了四川省主要杂交水稻亲本的DNA指纹数据库。本研究从DNA提取、PCR反应体系和程序及凝胶电泳等方面进行了技术体系的优化，建立了准确、简单、快速、成本低廉的快速鉴定籼粳交水稻种子纯度的技术体系。

发明内容

本发明提出一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，解决了现有技术中种子真实性和纯度的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，包括：

（1）种子DNA的直接提取（无需发芽）；

（2）PCR扩增反应；

所述PCR反应的体系中1对SSR引物有两种选择，一种选择序列为正向引物5’-CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’和反向引物

5’-GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’；

另一种选择序列为正向引物5’-CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’和反向引物5’-CTCAAGATGGACGCCAAGA-3’；

（3）凝胶电泳检测；

（4）种子纯度计算；

兼有父母特征主带的种子为目标种子，计数；

计算公式如下：受检种子批种子纯度（%）=受检种子中兼有父母本特征带型种子数/受检种子总数×100。