[发明专利]籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法

权利要求书

1.一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，包括：

（1）种子DNA的直接提取；其中种子无需发芽；

（2）PCR扩增反应；

所述PCR反应的体系中1对SSR引物有两种选择，一种选择序列为正向引物5’-CCAAAGATGAAACCTGGATTG-3’和反向引物

5’-GCACAAGGTGAGCAGTCC-3’；

另一种选择序列为正向引物5’-CAAAAACAGAGCAGATGAC-3’和反向引物5’-CTCAAGATGGACGCCAAGA-3’；

（3）凝胶电泳检测；

（4）种子纯度计算；

兼有父母特征主带的种子为目标种子，计数；

计算公式如下：受检种子批种子纯度（%）=受检种子中兼有父母本特征带型种子数/受检种子总数×100。

2.根据权利要求1所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述步骤（1）种子DNA的直接提取的步骤如下：将籼粳交杂交水稻种子剥去稃壳后放入离心管内；在组织磨样机上打磨30s；先后加入400μl提取液和120μl5mol/L醋酸钾；混匀后在4℃环境下静置10-15min；25℃下12000rpm离心10min-15min；取上清，先后加入无水乙醇400μl和3mol/L醋酸钠15μl；25℃下12000rpm离心10min-15min后去上清；加入400μl70%无水乙醇洗涤；4℃下12000rpm离心4min-6min；倒去上清，晾干后加入100μl双蒸水溶解，-20℃保存。

3.根据权利要求2所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述提取液由1mol/LTris-HCl，5mol/LNaCl，10%十二烷基硫酸钠，0.5mol/L乙二胺四乙二钠盐和双蒸水构成。

4.根据权利要求1所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述步骤（2）PCR扩增反应的具体步骤如下：在96孔PCR板中分别放入DNA模板、Mixed混合液、1对SSR引物和双蒸水；先94℃变性3min；再94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

5.根据权利要求1所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述步骤（3）凝胶电泳检测的具体步骤如下：安装玻璃板于电泳槽上；将配置好的胶液摇匀，灌胶，插梳子，等胶凝结后点样；电泳槽中加入缓冲液，110V，电泳2h；下胶后将凝胶浸在染色液中浸染10min；用双蒸水冲洗凝胶两遍，在显影液中显影5min；用自来水冲洗凝胶两遍后在凝胶电泳成像系统仪中拍照记录。

6.根据权利要求1所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述电泳槽中缓冲液为1×TBE，由三羟甲基氨基甲烷、硼酸和0.5mol/L乙二胺四乙二钠盐混合而成。

7.根据权利要求6所述的一种籼粳交型杂交水稻种子快速纯度鉴定方法，其特征在于，所述胶液由5×TBE、40%丙烯酰胺、10%过硫酸铵、四甲基乙二胺、双蒸水混合而成，它们的混合体积比为8∶6∶0.3∶0.024∶26。