[发明专利]超螺旋DNA含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体而言，本发明涉及一种超螺旋DNA含量的测定方法。

背景技术

在质粒类生物制品工业化生产中，超螺旋DNA是最终的目的产品。然而质粒DNA不仅与RNA、蛋白质等杂质掺合在一起，其中还有少量开环DNA的存在，进而在实际检测过程中干扰超螺旋DNA色谱峰，影响最终定量检测。现有检测超螺旋DNA含量技术中采用的毛细管凝胶电泳法或者琼脂糖凝胶电泳法均存在检测方法上的不足，如毛细管凝胶电泳法需要繁琐的样品处理，且不适合在质粒DNA生产的每一步中使用；琼脂糖凝胶电泳法在OD₂₆₀波长下检测范围太窄，并且样品稀释过程中很容易造成误差，准确度很低，也不适合在质粒DNA生产的每一步中使用。更重要地，是上述两种方法均无法定量地检测超螺旋DNA的含量。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种实现质粒DNA与RNA、蛋白质等杂质基线分离、定量检测超螺旋DNA含量的检测方法。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种超螺旋DNA含量的测定方法，该方法包括：采用AKTAexplorer^TM10检测仪器并利用分子筛色谱柱对待测样品进行第一检测分离处理，以便获得总DNA样品，计算总DNA样品的质量含量；以及采用嗜硫芳香色谱柱对所述总DNA样品进行第二检测分离处理，并计算超螺旋DNA在所述待测样品中的质量含量。

由此采用分子筛层析法使得RNA、蛋白质等杂质在内水体积中流出，而质粒DNA从外水体积中流出，完美地实现质粒DNA从RNA、蛋白质等其他杂质中的基线分离，减少了RNA、蛋白质等杂质在检测过程中对质粒DNA的干扰。在此基础上，利用吡啶环硫醚基团对超螺旋DNA的特异性亲和能力，实现超螺旋DNA与开环DNA的分离，通过计算两种DNA在色谱图中对应的峰面积，进而定量地测定超螺旋DNA在总DNA中的确切含量。本发明上述实施例的测定超螺旋DNA含量的测定方法与毛细管凝胶电泳法和琼脂糖凝胶电泳法相比，操作过程简单，检测过程中受杂质峰干扰小，具有安全、可靠、定量的特点，由此更加适用于实际工业化生产，效果良好。

另外，根据本发明上述实施例的超螺旋DNA含量的测定方法还可以具有如下附加的技术特征：

在本发明的一些实施例中，所述第一检测分离处理和所述第二检测分离处理采用的紫外检测波长分别为OD₂₆₀。由此可以进一步地减少RNA、蛋白质与开环DNA等杂质峰的干扰，提高超螺旋DNA含量测定的准确度。

在本发明的一些实施例中，所述分子筛色谱柱为5ml-HiTrap Sepharose HP色谱柱。由此可以实现质粒DNA与RNA、蛋白质等杂质的完美分离，得到DNA总含量。

在本发明的一些实施例中，所述嗜硫芳香色谱柱为1ml-HiTrap PlasmidSelect Xtra色谱柱。由此可以

在本发明的一些实施例中，所述第一检测分离处理是采用流动相A进行第一洗脱完成的，所述流动相A包含2.1M(NH₄)₂SO₄、10mM EDTA以及100mM Tris-Hcl，pH7.5。由此可以减少RNA、蛋白质等杂质的含量，降低RNA、蛋白质等杂质在色谱图中的干扰，进一步地提高超螺旋DNA含量的检测准确度。

在本发明的一些实施例中，所述第一洗脱的线性流速为60cm/h。由此可以进一步地提高检测的准确度。

在本发明的一些实施例中，所述第二检测分离处理是采用流动相B和流动相C进行第二洗脱完成的，所述流动相B包含2.25M(NH₄)₂SO₄、10mM EDTA以及100mM Tris-Hcl，pH7.5，所述流动相C包含2.0M NaCl、10mM EDTA以及100mM Tris-Hcl，pH7.5。

在本发明的一些实施例中，所述第二洗脱是以（100%流动相B、0%流动相C）～（45%流动相B、55%流动相C）的梯度洗脱方式进行的。由此可以进一步地实现超螺旋DNA与开环DNA的分离，减少杂质峰干扰，提高检测的灵敏度与准确度。

在本发明的一些实施例中，所述第二洗脱的线性流速为60cm/h，所述第二洗脱的洗脱体积为11个柱体积。由此可以进一步地提高检测的准确度。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。