[发明专利]一种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗及其应用，尤其涉及一种预防和治疗H3N8亚型马流感的重组腺病毒活载体马流感基因工程疫苗及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

马流感(Equine influenza，EI)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的马流感病毒(Equine influenza virus，EIV)引起的马属动物一种严重的常见上呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。OIE规定EI为法定报告动物疫病，我国将其列为三类传染病。

目前流行的EI主要为H3N8亚型，然而由于各种压力H3N8亚型EIV也在不断发生变异导致多个谱系病毒的出现，而且EIV已经跨越种间障碍，犬和猪感染EIV事件的发生，使得EI的防控具有重要的公共卫生学意义。近年来EI频繁暴发，自2003年以来，在英国及其他欧洲国家和美国经常有EI暴发的报道。此外，其他很少发生EI疫情的地区也已受到影响，如2003年至2004年在南非以及2008年在印度也暴发了EI疫情。澳大利亚这样从未发生过EI的国家于2007年也遭受了EI的袭击。

我国大陆地区一直以来都是EI的高发区。自建国以来我国共发生5次EI疫情。2007-2008年，我国暴发了第四次EI疫情，给我国的养马业及即将兴起的赛马业以沉重的打击。疫情首先在新疆暴发，随后蔓延至全国各地。2007年从新疆疫情中分离到一株H3N8亚型EIV，命名为A/Equine/Xinjiang/3/07(H3N8)（XJ3）。2009年在广西省以及2011年在贵州省也暴发了小规模EI疫情。自1974年我国首次暴发EI以来，除了海南，台湾和福建不曾有文献报道外，我国EI的分布几乎遍及大江南北。

当前疫苗接种是控制EI的效策略。我国曾开展EI疫苗研制工作，但这些疫苗早已不用，一旦EI发生后，主要采取一些对症治疗措施。目前我国所用疫苗都依赖于国外引进，主要是法国Merial公司生产的重组金丝雀活载体疫苗Proteq-Flu1。在2008年北京奥运马术比赛举办之际，为了预防EI，我国不得不从国外引进EI疫苗进行紧急预防接种。对我国分离的H3N8亚型EIV的序列分析表明：我国流行的EIV属于美洲谱系佛罗里达2群，而我国所使用的疫苗Proteq-Flu1所对应的美洲谱系疫苗株属于肯塔基亚谱系，两者比较，在HA基因上有15个位点氨基酸发生了变异，其中有8个分别位于A、B和C抗原区上，这警示我国的EIV正在进行变异，而且实验也证实进口疫苗对我国EI不能够提供完全保护。基于进口疫苗的昂贵价格，以及抗原针对性不强等缺点，开发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效EI基因工程活载体疫苗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组复制缺陷型腺病毒载体马流感基因工程疫苗，具体涉及一种预防和治疗马流感（EI）的重组复制缺陷型腺病毒活载体马流感基因工程疫苗，这种疫苗是以EIV XJ3囊膜糖蛋白HA作为保护性抗原的E1和E3联合缺失的复制缺陷型重组腺病毒rAd-XJ3-HA。

本发明以E1和E3联合缺失的复制缺陷型人腺病毒为载体，在E1区携带有EIV囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。

本发明的疫苗是以人腺病毒5型（ATCC VR5）为载体，将其缺失部分早期基因表达E1编码区（△481-3533bp）和E3编码区（△28130-30820bp），外源HA基因通过在大肠杆菌内同源重组整合入E1编码区。

本发明的疫苗中，所述的EIV囊膜糖蛋白，来源于我国流行的现地分离株XJ3HA基因全长cDNA，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，也可为编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或其部分编码序列，如HA1区（30-1067bp），或者与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列。在本发明的疫苗中，调控EIV囊膜糖蛋白HA基因进行表达的元件包括CMV启动子和SV40多聚腺苷酸加尾信号。rAd-XJ3-HA在动物细胞中并不复制，但能表达外源基因HA，其基因组在连续传代过程中保持稳定。