[发明专利]载脂蛋白B抗血清的制备方法

说明书

本发明公开了一种载脂蛋白B抗血清的制备方法，其技术方案要点是：1）将血清通过多阴离子化合物和二价金属离子处理获得低密度脂蛋白；2）将低密度脂蛋白中的杂蛋白除去，使其净含载脂蛋白B；3）将其作为抗原对免疫动物进行免疫，该发明的优势在于1）用多阴离子和二价金属离子制备浓缩的LDL粗品，使后续的超速离心次数和时间大大节省（20倍），为大批量提取ApoB提供了条件，2）合理提高抗原剂量免疫动物，可缩短抗血清的制备时间，只须传统方法的二分之一，而且免疫的效价和成功率亦比传统方法提高。

技术领域

本发明涉及一种生物医药领域，具体涉及一种载脂蛋白B抗血清的制备方法。

背景技术

载脂蛋白B（ApoB）是人血清中低密度脂蛋白（LDL）的主要结构蛋白，约占LDL蛋白质含量的97% ,其含量可反应LDL水平，血清中ApoB增高是心脑血管病的危险因素。临床上ApoB测定常作为心脑血管病的风险度估计。所有ApoB的免疫测定技术均需用ApoB抗血清，目前国际和国内通用的ApoB测定试剂盒均采用免疫比浊法(Immunoturbidimetric assay,ITA)，因其快速、准确、精密并适用于各种类型的自动生化分析仪，特别适用大批量标本的测定。为了满足临床检验需要，大批量制备高纯度ApoB抗血清显得非常重要。

传统制备载脂蛋白B抗血清是通过将采集的人的外周血液，直接用人的血清通过超速离心，将血清中加入半饱和硫酸铵，半饱和硫酸铵吸引溶液中在蛋白质表面不具有极性区域中的水分子，使水无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间相互吸引，从而将其中的蛋白沉淀，然后取下层沉淀，然后通过调节PH使沉淀下来的蛋白质复溶，然后将复溶的蛋白质进行上柱层析，将其层析物分部收集、浓缩，通过冷冻干燥剂进行冷冻干燥，并将其放置在零下80℃的条件下保存，然后将载脂蛋白B作为抗原，每次以3mg/每只免疫动物，对免疫动物进行免疫，获得载脂蛋白B抗血清。

传统方法制备载脂蛋白B直接从人的外周血液直接进行离心，离心次数多，且耗时长，而且用半饱和硫酸氨将蛋白质进行沉淀，蛋白质的复溶困难，要求高，免疫动物时免疫效价低，成功率小。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种载脂蛋白B抗血清的制备方法，该制备方法的优点有：

1）用多阴离子和二价金属离子制备浓缩的LDL粗品，使后续的超速离心次数和时间大大节省（20倍），为大批量提取ApoB提供了条件；

2）合理提高抗原剂量免疫动物，可缩短抗血清的制备时间，只须传统方法的二分之一，而且免疫的效价和成功率亦比传统方法提高。

为实现上述目的，本发明的载脂蛋白B抗血清的制备方法包括如下步骤：

1）血清的预处理：将用于制备载脂蛋白B的血清通过浓度为6%-22%的多阴离子化合物和浓度为2-8mol/L的二价金属离子处理后获得低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白；

2）净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白的提取：将获得的低密度脂蛋白依次经过生理盐水和0.5-1.1mol/L的草酸钾处理，离心过后取上层液进行透析获得低密度脂蛋白粗品，对低密度脂蛋白粗品用密度调节试剂进行密度调节，调节完成后进行超速离心，再通过凝胶柱层析获得净含载脂蛋白B的低密度脂蛋白；

3）载脂蛋白B抗血清的制备：将载脂蛋白B作为抗原对动物进行免疫反应，制备载脂蛋白B抗血清。

通过采用上述方案，先用较低浓度的多阴离子化合物和二价金属离子沉淀血清中的低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白，离心后将沉淀物用生理盐水溶解，接着再用草酸钾沉淀多阴离子，离心后上层液透析后即为LDL粗品（其浓度是血清中LDL含量的20倍），然后经超速离心，得到净含ApoB的LDL组份，这样一次超速离心提纯的LDL量相当于直接从血清中分离LDL量的20倍，大大节约了超速离心的次数和时间。