[发明专利]大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1及其制备和应用

权利要求书

1.一种大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1，其特征在于，所述融合蛋白MBP-MART-1是通过以下方法制备得到的：

通过PCR方法得到人MART-1基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体中，得到MART-1-pMAL-p5x重组载体，并将MART-1-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，经25～37℃培养16～20小时后，经PCR鉴定，得到含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌；

将该阳性大肠杆菌落接种于LB培养基中，25～37℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达3～4h后，将菌液离心弃上清，将菌体用细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1。

2.一种如权利要求1所述的大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1的制备方法，其特征在于，包括步骤：

1）通过PCR方法得到人MART-1基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体中，得到MART-1-pMAL-p5x重组载体；

2）将MART-1-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，在25～37℃培养16～20小时后，经PCR鉴定，得到含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌；

3）将含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌的单菌落接种于LB培养基中，25～37℃培养至OD₆₀₀=0.6～0.8，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达3～4h后，将菌液离心弃上清，将菌体用细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，PCR方法中的上下游引物分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2）中，大肠杆菌包括：大肠杆菌BL21（DE3）；

异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的用量为0.1～0.5mM；

细菌裂解液的配方为：每1000mL溶液中含有5～10mM咪唑、500～700mM氯化钠、20～30mM Tris和曲拉通X-10010mL。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，进行直链淀粉树脂纯化的操作包括：用柱缓冲液洗直链淀粉树脂柱，用含10～30mM麦芽糖的柱缓冲液洗脱蛋白，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1；

其中，柱缓冲液配方为：20～30ml 1.0-1.5M Tris-HCl、11.7g氯化钠和2.0ml0.5M EDTA的混合物。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，融合蛋白MBP-MART-1的纯度为95%以上。

7.一种如权利要求1所述的大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1的应用，其特征在于：所述融合蛋白MBP-MART-1在制备MART-1抗体中的应用。

8.一种表达融合蛋白MBP-MART-1的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌含权利要求2所述的MART-1-pMAL-p5x重组载体。

9.如权利要求8所述的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌是含MART-1-pMAL-p5x重组载体的大肠杆菌BL21（DE3）。