[发明专利]用于检测硫酸化寡糖的分析方法

说明书

本发明描述了使用与电离子检测器(charged aerosol detector；CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC‑UPLC)检测及定量多硫酸化寡糖(包括磺达肝素钠(Fondaparinux sodium))的分析方法。此分析方法通过分离、定量及质量(mass)鉴定在高度硫酸化寡糖的全合成中提供过程中控制。同时提供了使用该方法的系统及条件。

相关申请的交叉引用

不适用

背景技术

类肝素(肝素及硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate))是多个重要生物过程中已知的调节介质。类肝素及其衍生物低分子量肝素(low-molecular weight heparin,LMWH)已在外科手术及肾透析期间用作临床抗凝血药物。例如，磺达肝素钠(CAS114870-03-0)是化学名称为O-[2-脱氧-6-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-吡喃葡萄糖]-(1--4)-O-(β-D-吡喃葡萄糖醛酸)-(l--4)-O-[2-脱氧-3，6-二-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-吡喃葡萄糖]-(l--4)-O-(2-O-磺酸基-α-L-吡喃艾杜糖醛酸)-(1--4)-O-[2-脱氧-1-O-甲基-6-O-磺酸基-2-(磺酰胺基)-α-D-葡萄吡喃糖苷]十钠盐的寡糖/肝素中的一员，由Choay，S.A.研发(参见美国专利第4,818,816号)。该化合物是一合成的戊多糖因子Xa抑制剂，其用作预防经骨外科手术的患者的深层静脉栓塞以及治疗深层静脉栓塞及肺栓塞的抗凝血药物。磺达肝素钠于2001年经美国食品药物管理局批准，以商品名Arixtra^TM出售。磺达肝素钠为皮下用药。

肝素及硫酸乙酰肝素分析方法在传统上涉及逆相层析及质谱(MS)技术，但因硫酸乙酰肝素的高极性、结构多样性及硫酸盐不稳定性而存在限制。例如，使用MS对于合成的多硫酸化寡糖进行定量受到限制，因为多硫酸化寡糖离子化时易于形成多种类型硫酸根基团损失的片段及金属阳离子偶合加成物，这会导致更大的质谱复杂性及信号分裂。另外，在分析期间难以显示硫酸根基团的损失程度，因为其取决于硫酸化寡糖的浓度及电荷态。改良的多硫酸化寡糖分析方法是多组研究团队的目标。

Catalin等人(Anal.Chem.2009，81,3485)及Tatiana等人(Anal.Chem.2006，78,1774)已分别阐述了通过使用电喷洒游离质谱(ESI-MS)及基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)来表征多硫酸化寡糖。然而，目前使用液相层析(LC)与质谱偶联的方法无法提供在线过程内层析峰的解析/分离且因此在产生合成的多硫酸化寡糖期间无法建立结构相关杂质的鉴定和/或多硫酸化寡糖的定量。

Imanari等人(J.Chromatogr.,A 1996,720,275.)及Rice等人(J.Anal.Biochem.1985，150，325.)阐述了借助强阴离子交换层析(SAX)分析多硫酸化寡糖的方法。此方法使用电荷密度差异来分离高度硫酸化寡糖，但因在流动相组合物中使用非挥发性盐类，故仍难以直接将SAX与像MS的检测方法偶联。

与多硫酸化寡糖分析方法相关的另一些问题是因多硫酸化寡糖的非发色特性(极低UV吸收)所致，此会限制传统UV检测器的使用。其他通用检测器(例如折射率(RI)检测器及蒸发光散射检测器(ELSD))亦对多硫酸化寡糖缺乏足够检测灵敏度。

尽管已公开了一些多硫酸化寡糖检测方法，但仍存在多种限制。因此，仍需要改良用于多硫酸化寡糖的分离、定量及质量(mass)鉴定的方法。本文所公开的稳定、灵敏且过程中控制(in-process control，IPC)方法解决了此需要及其他需要。

发明概要

本文提供使用与电离子检测器(charged aerosol detector，CAD)或质谱仪(MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪(HILIC-UPLC)检测多硫酸化寡糖的方法。本文所提供方法使得峰分辨率改良，因而允许样品中多硫酸化寡糖和/或杂质的后续定量。