[发明专利]基于CRISPR的基因组修饰和调控

说明书

本发明提供经工程改造用于在真核细胞或胚胎中表达的RNA指导的核酸内切酶，和在真核细胞或胚胎中将RNA指导的核酸内切酶用于靶基因组修饰的方法。也提供融合蛋白，其中各融合蛋白包含CRISPR/Cas样蛋白或其片段和效应子结构域。效应子结构域可以是剪切结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域或转录抑制子结构域。也提供使用融合蛋白修饰染色体序列或调控染色体序列表达的方法。

技术领域

本公开内容涉及靶基因组修饰。具体而言，本公开涉及RNA指导的核酸内切酶或包含CRISPR/Cas样蛋白的融合蛋白和使用所述蛋白修饰修饰或调控靶染色体序列的方法。

发明背景

靶基因组修饰是用于真核细胞、胚胎和动物的基因操作的有力的工具。例如，外源序列可以被整合在靶基因组位置和/或特定的内源染色体序列可以被缺失、失活或修饰。当前的方法依赖于工程化核酸酶的使用，工程化核酸酶例如，锌指核酸酶(ZFNs)或转录激活子样效应子核酸酶(TALENs)。这些嵌合核酸酶含有与非特异性DNA剪切结构域连接的可编程的、序列特异性的DNA结合组件。但是，各个新的基因组靶需要设计包含新的序列特异性的DNA-结合组件的新ZFN或TALEN。因此，这些用户定制设计的核酸酶往往制备昂贵且耗时。此外，ZFNs和TALENS的特异性使得它们能介导脱靶剪切。

因此，需要不要求针对每个新的靶基因组位置设计新的核酸酶的靶基因组修饰技术。另外，需要特异性增加的具有很少或没有脱靶作用的技术。

发明概述

在本公开内容的不同方面之中提供分离的RNA指导的核酸内切酶，其中所述核酸内切酶包含至少一个核定位信号、至少一个核酸酶结构域和至少一个与指导RNA相互作用以将核酸内切酶靶向用于剪切的特定核苷酸序列的结构域。在一个实施方案中，所述核酸内切酶可衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，所述核酸内切酶可经修饰而缺失至少一个功能性核酸酶结构域。在其它实施方案中，所述核酸内切酶可进一步包含细胞穿透结构域、标志物结构域，或二者。在进一步的实施方案中，所述核酸内切酶可以是包含指导RNA的蛋白-RNA复合物的一部分。在一些情况下，所述指导RNA可以是包含与靶位点互补的5’区域的单分子。也提供编码任一本文公开的RNA指导的核酸内切酶的分离的核酸。在一些实施方案中，所述核酸可以是针对在哺乳动物细胞(例如，人细胞)中翻译而最优化的密码子。在其它实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的核酸序列可以与启动子控制序列可操作性地连接，并任选地可以是载体的一部分。在其它实施方案中，包含可以与启动子控制序列可操作性地连接的编码RNA指导的核酸内切酶的序列的载体也可包含可以与启动子控制序列可操作性连接的编码指导RNA的序列。

本发明的另一方面包括用于在真核细胞或胚胎中修饰染色体序列的方法。该方法包括向真核细胞或胚胎中引入(i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种如本文所定义的RNA指导的核酸内切酶的核酸，(ii)至少一种指导RNA或编码至少一种指导RNA的DNA，和任选(iii)至少一种包含供体序列的供体多核苷酸。该方法进一步包括培养所述细胞或胚胎以便各指导RNA将RNA指导的核酸内切酶定向至染色体序列中的靶位点，其中所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入所述靶位点，并且所述双链断裂通过DNA修复过程而修复以便修饰染色体序列。在一个实施方案中，所述RNA指导的核酸内切酶可以衍生自Cas9蛋白。在另一实施方案中，编码引入细胞或胚胎中的RNA指导的核酸内切酶的核酸可以是mRNA。在进一步的实施方案中，其中编码引入细胞或胚胎的RNA指导的核酸内切酶的核酸可以是DNA。在进一步的实施方案中，编码RNA指导的核酸内切酶的DNA可以是另外包含编码指导RNA的序列的载体的一部分。在某些实施方案中，所述真核细胞可以是人细胞、非人哺乳动物细胞、干细胞、非哺乳动物的脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞或单细胞真核生物。在某些其它实施方案中，所述胚胎是非人单细胞动物胚胎。