[发明专利]基于CRISPR的基因组修饰和调控有效

申请号：	201380072477.4	申请日：	2013-12-05
公开（公告）号：	CN105142669B	公开（公告）日：	2018-07-03
发明（设计）人：	F．陈;G．D．戴维斯	申请（专利权）人：	西格马－奥尔德里奇有限责任公司
主分类号：	A61K45/00	分类号：	A61K45/00
代理公司：	中国专利代理(香港)有限公司 72001	代理人：	黄登高;黄希贵
地址：	美国密***	国省代码：	美国;US
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摘要：
搜索关键词：	融合蛋白结构域核酸内切酶染色体序列真核细胞效应子修饰胚胎转录激活结构域基因组修饰靶基因组工程改造剪切结构遗传修饰转录抑制子结构调控蛋白
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【权利要求书】：

1.用于整合外源序列到真核细胞的染色体序列的方法，所述方法包括：

a) 向真核细胞引入(i)至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶或编码至少一种包含至少一个核定位信号的RNA指导的核酸内切酶的核酸，其中所述至少一种RNA指导的核酸内切酶是成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关的(Cas)(CRISPR/Cas)类型II系统蛋白并且所述CRISPR/Cas类型II系统蛋白是Cas9蛋白，

(ii)至少一种编码至少一种指导RNA的指导RNA或DNA，和

(iii)至少一种包含外源序列的供体多核苷酸；和

b)培养所述真核细胞使得所述指导RNA将所述RNA指导的核酸内切酶定向至染色体序列中的靶位点和原间隔毗连基序(PAM)，其中所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复使得所述外源序列整合到染色体序列。

2.用于整合外源序列到真核细胞的染色体序列的离体或体外方法，所述方法包括：

(ii)至少一种编码至少一种指导RNA的指导RNA或DNA，和

(iii)至少一种包含外源序列的供体多核苷酸；和

b)培养所述真核细胞使得所述指导RNA指导所述RNA指导的核酸内切酶至染色体序列中的靶位点和原间隔毗连基序(PAM)，其中所述RNA指导的核酸内切酶将双链断裂引入，并且所述双链断裂通过DNA修复过程修复使得所述外源序列整合到染色体序列。

3.权利要求1或2的方法，其中所述RNA指导的核酸内切酶进一步包含标志物结构域。

4.权利要求1或2的方法，其中编码所述RNA指导的核酸内切酶的核酸是mRNA。

5.权利要求1或2的方法，其中编码所述RNA指导的核酸内切酶的核酸是DNA。

6.权利要求5的方法，其中所述DNA是载体的一部分，所述载体进一步包含编码指导RNA的序列。

7.权利要求1或2的方法，其中所述真核细胞是人细胞、非人哺乳动物细胞、干细胞、非哺乳动物的脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞、植物细胞或单细胞真核生物。