[发明专利]促进抗原序列的李斯特菌表达的信号肽融合配偶体以及其制备和使用方法

说明书

本发明提供核酸、表达系统和疫苗菌株，所述核酸、表达系统和疫苗菌株提供目标抗原向宿主细胞的胞质溶胶中的有效表达和分泌，并且通过将作为N‑末端融合配偶体的李斯特菌或其它细菌的信号肽/分泌陪伴分子在翻译读码框中与所选重组编码蛋白抗原功能性连接来引发有效的CD4和CD8T细胞反应。使这些N‑末端融合配偶体缺失(通过实际缺失、通过突变或通过这些途径的组合)所述序列原有的任何PEST序列和/或某些疏水性残基。

本发明要求2012年12月27日提交的美国临时专利申请61/746,237和2013年3月13日提交的美国临时专利申请61/780,744的优先权，这两个美国临时专利申请各自以其整体(包括所有表、图和权利要求)特此以引用方式并入。

发明背景

提供以下对本发明背景技术的论述仅为了帮助读者理解本发明，而不承认是描述或构成本发明的现有技术。

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes/Lm)是兼性细胞内细菌，其特征在于其能够诱导深度的先天免疫反应，从而产生对疫苗编码的抗原具有特异性的稳健且高功能性的CD4和CD8T细胞免疫。Lm是在免疫受损个体(包括患有癌症或其它病毒诱发的免疫缺陷的患者、孕妇、老年人和婴儿)中的致病性增加的食源性细菌。

经工程化成编码与所选靶向病原体或恶性病相关的指定抗原的重组修饰的Lm疫苗平台已构成若干人类临床试验的基础。由于李斯特菌属(Listeria)可以是致病性生物体并且在免疫受损的情况下尤其如此，因此优选施用步骤包括施用编码目标抗原的可表达免疫活性部分的减毒李斯特菌属。“减毒”是指对细菌进行修饰以减少或消除其致病性，但保持其充当目标疾病的预防剂或治疗剂的能力的过程。举例来说，缺失两个毒力基因并且在小鼠李斯特菌病模型中减毒>3log的经遗传界定的减毒活LmΔactAΔinlB保持其免疫效力并且已在人疾病的小鼠模型中以及在人体中均显示诱导稳健的CD4和CD8T细胞免疫，并且已在患有不同实体瘤恶性病的患者中在临床环境中显示是安全和耐受良好的。

李斯特菌属菌株最通常经工程化成分泌作为与所分泌的李斯特菌蛋白(例如李斯特菌溶血素O(LLO)或ActA)的全部或一部分的融合物的肿瘤抗原。已表明，关于所述疫苗构建体的功效的可能原因可能是LLO和ActA内存在被称为“PEST”基序的氨基酸序列。PEST区(P，脯氨酸；E，谷氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸)是存在于某些蛋白的NH2或COOH末端附近的亲水性氨基酸序列。认为其靶向被细胞蛋白酶体快速降解的蛋白。为了被T淋巴细胞识别，必须将蛋白抗原转化成结合展示于抗原呈递细胞表面上的MHC分子的短肽。并且实际上已表明LLO的PEST区对于李斯特菌疫苗的成功至关重要，因为可通过缩短蛋白的细胞半衰期来增加可用于通过MHC I类分子呈递的肽的供应。

发明概要

本发明提供核酸、表达系统和疫苗菌株，所述核酸、表达系统和疫苗菌株提供目标抗原向宿主细胞的胞质溶胶中的有效表达和分泌，并且通过将作为N-末端融合配偶体的李斯特菌或其它细菌的信号肽/分泌陪伴分子在翻译读码框中与所选重组编码的蛋白抗原功能性连接来引发有效的CD4和CD8T细胞反应。这些细菌N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体引导从重组细菌合成的融合蛋白在受感染宿主哺乳动物细胞中的分泌。如下文所述，使这些N-末端融合配偶体缺失(通过实际缺失、通过突变或通过这些途径的组合)所述序列原有的任何PEST序列。

相对于天然多肽序列在PEST序列的修饰方面以及任选地在长度和/或信号序列外部疏水性基序的存在方面对细菌N-末端信号肽/分泌陪伴分子融合配偶体进行了修饰。举例来说，ActA可被截短而缺失C-末端膜结合结构域，并且在某些实施方案中甚至进一步减少融合蛋白中非抗原残基的数目。另外，还使这些N-末端融合配偶体中并非信号序列的一部分以及形成多肽序列中的疏水性基序的一个或多个疏水性残基缺失(再次通过实际缺失，通过突变，或通过这些途径的组合)。所得融合蛋白以高水平表达并且对含于所述融合蛋白中的目标抗原产生稳健的免疫反应。

在第一方面，本发明涉及多核苷酸，其包含：

(a)启动子；和