[发明专利]用于在丝状真菌中产生位点特异性突变的方法

权利要求书

1.一种提供位点特异性突变的变体多肽的方法，该方法包括下述步骤：

a)提供一种甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体，该甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体包括一种编码亲本多肽的亲本多核苷酸；

b)提供一对针对该亲本多核苷酸的端对端非重叠PCR引物，其中至少一个引物是诱变的；

c)用该PCR引物对进行该模板载体的PCR扩增以产生全长的载体突变的PCR片段；

d)用一种适合的甲基化特异性核酸酶去除该模板载体；

e)通过自连环化这些突变的PCR片段；并且

f)将这些环化的突变的PCR片段直接转化至丝状真菌宿主细胞中以表达这些变体多肽，

其中将这些PCR引物在该PCR扩增前磷酸化，或者将这些PCR片段在该自连步骤前或期间磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。

2.如权利要求1所述的方法，其中该亲本多肽是一种酶，优选水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；优选地，该酶是氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中该模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体是一种包含AMA1真菌复制起始序列的质粒。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该至少一个诱变引物与其针对的亲本多核苷酸是完全互补的，除了被设计为在产生的编码这些变体多肽的一个或多个PCR片段中编码一个或多个氨基酸插入、取代或缺失的一种或多种位点特异性点突变之外。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中这些端对端非重叠PCR引物中的每个的长度为至少20个核苷酸，优选地长度为至少25、30、35、40、45，或最优选地至少50个核苷酸。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体由一种识别GATC的甲基化酶在体内或体外甲基化；优选地，该甲基化酶是Dam。

7.如权利要求6所述的方法，其中这种用于去除该模板载体的甲基化特异性核酸酶识别Dam甲基化；优选地，该甲基化特异性核酸酶是Dpn1。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将这些PCR引物在该PCR扩增前磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。

9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将这些PCR片段在该自连步骤前或期间磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞是一种曲霉属细胞；优选地，该曲霉属细胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，该方法包括至少一个另外的筛选或选择这些表达的变体多肽的步骤，以鉴定具有一种或多种感兴趣的改变特征的一种或多种变体。