[发明专利]用于重组蛋白质的改进的收获操作

说明书

本发明涉及产生重组蛋白质的方法，其包括发酵原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，在dO₂水平大于0％的条件下收获所述重组蛋白质，将所述重组蛋白质纯化成的经过滤的储备物，其中通过如IEC测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的DHNA‑重组蛋白质加合物。此外，还提供产生重组蛋白质的方法，其包括发酵缺失menE基因的原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，收获所述重组蛋白质，将所述重组蛋白质纯化成经过滤的储备物，其中如通过IEC测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含可检测的DHNA‑重组蛋白质加合物，其中将重组蛋白质产量增加约20％或者更多。

相关申请的交互引用

本申请要求2012年3月27日提交的临时美国申请号61/616,297的优先权的权益，将所述申请以其整体并入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及用于在原核宿主细胞中培养重组蛋白质的改进方法。

发明背景

对于活的生物技术产品而言，蛋白质的大规模经济纯化是必须的。通常，使用哺乳动物或细菌细胞系，通过细胞培养产生蛋白质，通过插入含该蛋白质的基因的重组质粒来改造所述哺乳动物或细菌细胞系以产生目的蛋白质。由于所使用的细胞系是活的生物，所以必须使用复合生长培养基培养它们，所述复合生长培养基通常含有盐、糖、氨基酸、维生素、痕量元素和蛋白胨的混合物。从培养细胞的化合物的混合物中以及从细胞自身的副产物中分离期望的蛋白质达到足够用作为人类治疗剂的纯度是一种艰难的挑战。

通常在几种宿主细胞系中产生重组治疗性蛋白质，包括哺乳动物宿主细胞例如，鼠骨髓瘤NS0和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Anderson,D.C和Krummen,L.(2002)Curr.Opin.Biotech.13:117-123；Chu,L.和Robinson,D.K.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:180-187)以及细菌宿主细胞包括大肠杆菌Escherichia coli(E.coli)。就产率和由细胞产生的蛋白质的特征而言，每一细胞系都具有优点和缺点。大肠杆菌已经最广泛地用于治疗性蛋白质的大规模产生，其不需要用于生物活性的复合糖基化。由大肠杆菌表达的异源蛋白质可以聚积成可溶性产物或者不溶性聚集体。通常，为了分离蛋白质，可以将细胞进行用于周质提取的处理或者裂解以释放用其它方法无法接近的胞内产物。发酵和细胞培养技术的发展极大地增加了目标重组蛋白质的滴度。

选择市售产品细胞系通常平衡了对于高产率的需求和递送给定产品所需的产品质量特性的能力。在cGMP发酵协议下，质量已经构建到整个工艺中，以确保就安全性、产品同一性、质量和纯度而言，符合管理机构的需求。然而，偶然会出现给定产品不符合其规格的问题。存在的挑战是研发健全的工艺，其中鉴别并分离不符合规格的产品，然后减少不符合规格的产品的出现，以使工艺控制可以维持在已建立的参数范围内，并确保工艺持续产生符合产品规格的产品。本领域存在减轻或消除不符合规格的产品的发生率的需求。

发明概述

本发明涉及产生重组蛋白质的方法，其包括(a)发酵原核宿主细胞，其中已经用编码所述重组蛋白质的核酸转化所述原核宿主细胞，和(b)在溶解氧(dO₂)水平大于0％的条件下收获所述重组蛋白质，以及(c)将所述重组蛋白质纯化成用于储存的经过滤的储备物(filtered bulk for storage)(FBS)，其中通过分析测定法如离子交换层析(IEC)测定法在310nm处所测量，所述经过滤的储备物不含有可检测的1,4-二羟基-2-萘甲酸(DHNA)-重组蛋白质加合物。在一个实施方案中，在上述方法中，分析测定法是HPLC、RP HPLC、HICHPLC、NMR、质谱法或UV光谱学。