[发明专利]用于分子计数的组合物和试剂盒

权利要求书

1.一种确定样品中mRNA分子的出现次数的方法，其包括：

(a)使用多个寡核苷酸标签随机标记样品中的多个mRNA分子的出现的mRNA分子以产生多个标记的mRNA分子，

(i)其中所述多个mRNA分子包括具有不同序列的mRNA分子，

(ii)其中所述多个寡核苷酸标签中的每个寡核苷酸标签包含oligo dT序列、标识符区域和通用引物结合位点，

(iii)其中所述多个寡核苷酸标签包括至少10个具有不同序列的标识符区域的寡核苷酸标签，所述标识符区域用于确定所述多个mRNA分子的mRNA分子的出现次数，且

(iv)其中所述多个寡核苷酸标签中具有不同序列的标识符区域的寡核苷酸标签的数目是所述多个mRNA分子的任何mRNA分子的出现次数的至少10倍；

(b)通过使所述多个标记的mRNA分子与逆转录酶接触进行第一链合成反应，以产生多个标记的单链cDNA分子；

(c)扩增所述多个标记的单链cDNA分子以产生多个标记的双链cDNA分子；

(d)对所述多个标记的双链cDNA分子进行巢式聚合酶链反应(PCR)，以产生多个标记的巢式PCR扩增子；和

(e)检测所述多个标记的巢式PCR扩增子的至少一部分扩增子以确定关联于所述多个标记的mRNA分子的每一个的不同的标识符区域的数目，从而确定样品中所述多个mRNA分子的mRNA分子的出现次数，

其中所述方法用于非诊断目的。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述检测包括在固相支持体上检测所述多个标记的巢式PCR扩增子的至少一部分扩增子。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述固相支持体是阵列。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述固相支持体是可寻址的阵列。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述固相支持体是珠粒。

6.如权利要求1所述的方法，其中进行所述巢式PCR包括使所述多个标记的双链cDNA分子变性，以产生多个变性的标记的单链cDNA分子。

7.如权利要求6所述的方法，其中进行所述巢式PCR进一步包括使第二靶标特异性引物与所述多个变性的标记的单链cDNA分子退火。

8.如权利要求7所述的方法，其中进行所述巢式PCR进一步包括使通用引物与所述寡核苷酸标签的通用引物结合位点退火。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其进一步包括进行测序反应以确定所述寡核苷酸标签的至少一部分、所述多个标记的巢式PCR扩增子的至少一部分扩增子或其任意组合的序列。

10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中检测所述多个标记的巢式PCR扩增子的至少一部分扩增子包括用阵列检测器、荧光读取器或非荧光检测器检测。

11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中检测所述多个标记的巢式PCR扩增子的至少一部分扩增子包括用CR读取器或扫描仪检测。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述阵列检测器是平板扫描仪。

13.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述样品来自单个细胞。

14.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述样品来自少于100个细胞。

15.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述样品来自少于5个细胞。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。