[发明专利]一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域，具体涉及一种单甲氧基聚乙二醇修饰的猪胰高血糖素样肽-2（porcine glucagon-like peptide-2, pGLP-2），即一种单甲氧基聚乙二醇-猪胰高血糖素样肽-2复合物及其制备方法和应用。

背景技术

胰高血糖素样肽-2（glucagon-like peptide-2, GLP-2）是胰高血糖素原基因转录、翻译后处理加工的33个氨基酸的胰高血糖素衍生肽之一，主要由远端回肠和结肠的L细胞分泌。GLP-2通过特异性促进肠上皮增殖、抑制肠上皮凋亡、增加肠道血供、抑制胃酸分泌、降低肠道通透性等多方面促进损伤肠粘膜的结构恢复和屏障功能改善，且作用强于以往发现的其他非特异的肠生长因子，为治疗仔猪肠道损伤和功能紊乱提供了广阔的研究前景。pGLP-2与hGLP-2具有相似的肠道促生长作用，同源性为82%，通过C端延长，含有35个氨基酸。

但是，在猪体内，pGLP-2易被体内广泛存在的二肽酰肽酶-IV（dipeptidyl peptidase-IV, DPP-IV）快速降解掉N端的前两个氨基酸His¹-Ala²，体内半衰期为8.4min，严重制约了其推广应用。

聚乙二醇（PEG）是一种亲水、不带电荷的线性大分子，蛋白质经PEG修饰后，分子量增加，肾小球的滤过减少，PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶水解，有助于蛋白质类药物半衰期的延长。但蛋白PEG修饰产物的分离纯化均比较困难。原因如下：（1）蛋白经PEG修饰后，许多理化性质发生了改变，如等电点、分子质量、溶解度、沉降系数等；（2）PEG分子在水溶液中具有伸展的构象，其流体动力学体积远远大于同样分子质量的球状蛋白，使得与PEG的分离非常困难；（3）PEG分子的不均一性，存在一定的分子质量分布，因此即使包含相同PEG个数的同一种蛋白质，其相对分子量也不完全相同；（4）蛋白质表面可修饰的氨基酸位点较多时，PEG分子可结合在多个不同的氨基酸残基上，使PEG修饰蛋白的空间结构进一步复杂化。以上为蛋白PEG修饰及产品开发的核心与难点所在。

目前，通过PEG修饰pGLP-2延长其半衰期治疗仔猪肠道疾病的研究未见报道。

发明内容

针对pGLP-2中仅含有一个Lys残基的优势，本发明的第一个目的是提供一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物，该复合物得到单点修饰产物，从而避免了修饰位点的多态性，使后续纯化简便。mPEG-SPA-pGLP-2复合物保留了pGLP-2的生物学活性，与pGLP-2相比，半衰期延长，可更方便地应用于肠道疾病的治疗。本发明的第二个目的是提供上述的一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制备方法。本发明的本发明的第三个目的是提供上述的一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物的制药用途。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种mPEG-SPA-pGLP-2复合物，由猪胰高血糖素样肽-2（porcine glucagon-like peptide-2, pGLP-2）与单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯（methoxy-polyethylene glycol-succinimidyl-propionic acid ester, mPEG-SPA）通过加成反应连接构成，所述pGLP-2第30位的Lys与所述mPEG-SPA的末端双键形成共价键而连接。

作为优选，所述的pGLP-2的氨基酸序列为：His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Val-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Thr-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Leu-His-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-Ser-Leu-NH₂。

作为优选，所述单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯的分子量为5~20KD。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种制备上述任一技术方案所述的mPEG-SPA-pGLP-2复合物的方法，该方法包括以下的步骤：

1）将pGLP-2制备成pH为7.5~9.0的溶液；

2）将步骤1）制备的pGLP-2溶液与mPEG-SPA反应，所述pGLP-2与mPEG-SPA的摩尔浓度比为1：1~1：8，反应温度为4~37℃，反应时间为0.5~24小时；