[发明专利]一种糖化酶及重组表达糖化酶的工程菌株

说明书

技术领域

本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种糖化酶及重组表达糖化酶的里氏木霉工程菌株。

背景技术

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase），它能把淀粉从非还原性末端水解α-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖。糖化酶的底物专一性较低，它除了能从淀粉链的非还原性末端切开α-1，4键处，也能缓慢切开α-1，6糖苷键。因此，它能很快的把直链淀粉从非还原性末端依次切下葡萄糖单位，在遇到1，6键时，先将α-1，6键分割，再将α-1，4键分割，从而使支链淀粉水解成葡萄糖。

糖化酶用途广泛，用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵，还可用于生产各种规格的葡萄糖。凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。糖化酶对设备没有腐蚀，使用安全，且工艺简单、性能稳定，利用糖化酶对淀粉进行水解比较安全，还有利于实现生产机械化和文明生产。

目前常用的糖化酶均是来自黑曲霉。自70年代中期开始，中科院微生物所筛选获得了高产糖化酶菌株AS.3.4309。该菌株国内许多大型抗生素制药厂、酒精厂、酿酒厂进行了生产规模试验，均获得成功。该项目的成功为我国发酵行业节约了大量的粮食，产生了巨大的经济效益和社会效益。市场越来越密切关注高转化率糖化酶，这使得克隆和表达高转化率糖化酶成为研究的热点之一。蛋白表达系统是黑曲霉，其产酶量（蛋白量）较高，但是受到糖化酶本身性质的影响，黑曲霉表达糖化酶的比活比较低，不能适应市场的需求。因此，开发性能优良、比活高的糖化酶越来越受到各方的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型糖化酶及重组表达该糖化酶的基因工程菌。本发明将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉（Trichoderma reesei）中进行表达，构建得到高效表达该糖化酶的重组菌株，显著提高了糖化酶的产量，有利于糖化酶的广泛应用。

本发明一方面涉及一种糖化酶，其特征在于，所述糖化酶包括：

a)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的酶；

b)其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相似性高于90%以上，且具有糖化酶功能的酶。

所述糖化酶的编码基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面涉及携带有上述糖化酶基因的表达载体。

本发明还提供用于重组表达糖化酶的里氏木霉（Trichoderma reesei）。

本发明还涉及上述糖化酶的应用。

本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达，酶活水平达到413U/mL。所述糖化酶的最适作用温度为75℃，在70℃-80℃范围内能保持80%以上的酶活；最适作用pH为6.0，且在pH4.0-7.0范围内，能保持70%以上的酶活。。该糖化酶可广泛应用于葡萄糖的生产中，2.5h时，其DE值（还原糖值）达到最高为97%；所述糖化酶专一性强，能高效分解α-1,4-糖苷键，产物中葡萄糖的含量高达90%。而且所述糖化酶的耐温性好，所以淀粉液化后可以不用增加降温步骤，直接加入本发明所述糖化酶进行酶解反应，从而节省工时和能源，更节约了生产成本，市场前景广阔。

附图说明

图1为本发明构建的表达载体质粒图谱。

图2为里氏木霉工程菌发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指为重组表达的糖化酶。

图3为本发明所述糖化酶作用温度-相对酶活曲线图。

图4为糖化酶VL-2和VL-3作用温度-相对酶活曲线图。

图5为本发明所述糖化酶作用pH-相对酶活曲线图。

图6为糖化酶VL-2和VL-3作用pH-相对酶活曲线图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。