[发明专利]一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于医学检测领域，尤其涉及一种microRNA (miRNA)的检测方法，具体是基于表面等离子体共振(SPR)以及金纳米棒信号放大的超灵敏和无标记快速microRNA (miRNA)检测方法，属于医学检测领域。

 

技术背景

MicroRNAs (miRNAs)是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA, 在基因转录后调控中发挥至关重要的作用，广泛存在于动植物体内，越来越多的证据表明, miRNAs参与很多重要的生理和病理过程, 例如发育、器官形成、调亡、细胞增殖、肿瘤发生等。因此，miRNAs分析检测就成了我们进一步研究其生物功能，疾病诊断和治疗以及相关基因药物开发的关键技术。

贵金属纳米材料由于其独特的光物理及化学性质、良好的生物相容性、低毒性，在miRNA分析中扮演者重要的角色并且被广泛应用于各种生物传感器。

SPR技术是一种基于芯片表面折射率或质量变化的光学检测技术，具有灵敏、快速、免标记等优点，可实时在线跟踪固液界面上的反应，在蛋白质和核酸等生物分子检测方面具有广阔的应用前景。但是传统的SPR检测方法难以直接检测低分子量、超低浓度的分子。miRNAs序列短、缺乏共同的特征、含量少、在细胞中表达丰度低，因此直接利用传统的SPR技术很难检测。大部分SPR传感器都是基于球形金纳米颗粒的，有关金纳米棒(GNRs)的研究较少。

发明内容

本发明解决的技术问题为，传统的SPR方法难以直接检测低分子量、超低浓度分子，本发明公开一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片及其制备方法和应用，目的在于提供一种低成本、速度快的测试方法，及一种可再生并且重复使用、效果好的SPR传感芯片。

为实现上述目的本发明采取如下的技术方案。

    本发明涉及一种表面等离子体共振(SPR)传感芯片，所述SPR传感芯片的结构为，先在基质玻璃片表面依次镀上铬膜和金膜，在所镀的金膜表面修饰生物素-miRNA探针。

    所述SPR传感芯片的优选技术方案为，所述修饰生物素-miRNA探针用三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原巯基，用6-巯基1-己醇(MCH)封堵。

    本发明还涉及上述传感芯片的制备方法，首先在基质玻璃片上制备厚度为1～3 nm的铬膜，在其上制备厚度为40～60 nm的金膜；然后在金膜上固定探针，将包含三(2-羧乙基)膦(TCEP)的磷酸缓冲液(PBS)的生物素-miRNA探针滴到金膜上，过夜；固定探针后，用PBS溶液洗去未结合的探针，将得到的金膜用6-巯基1-己醇(MCH)封堵后冲洗，得到SPR传感芯片。

    所述传感芯片制备方法的优选技术方案为，所述金膜上固定探针的方法为，将25 μL 0.1 μM的生物素-miRNA探针滴到金膜上，其中包含0.1 M, pH 7.4磷酸缓冲液（PBS），在PBS中含有2 μM三(2-羧乙基)膦(TCEP)。

    所述传感芯片制备方法的优选技术方案为，固定探针经过清洗后，用1.45×10^?6M的6-巯基1-己醇(MCH)封堵。

    本发明还涉及上述传感芯片的应用，所述SPR传感芯片与金纳米棒(GNRs)-链霉亲和素用于检测miRNA、DNA、蛋白质、抗原的含量。

    所述传感芯片应用的优选技术方案为，所述miRNA含量的检测，是将SPR传感芯片置于SPR检测通道上、将不同浓度的目标miRNA注射到流动分析池，miRNA与生物素-miRNA探针杂交形成双链使生物素暴露出来，记录其对应的SPR信号响应。然后在低浓度miRNA时，注入GNRs-链霉亲和素，记录其对应的SPR信号响应，根据标准曲线，确定miRNA的浓度。

    所述传感芯片应用的优选技术方案为，在低浓度miRNA时所用的缓冲液为10 mM PBS (pH=7.4)。

    所述传感芯片应用的优选技术方案为，所述检测结束后，向SPR检测通道中分别注射2 mM的NaOH和2 mM的HCl，用于洗脱结合的GNRs-链霉亲和miRNA，即可测试下一个样品。

    所述传感芯片应用的优选技术方案为，所述方法可测量的miRNA低浓度为0.1～100 pM。

    所述传感芯片应用的优选技术方案为，所述金纳米棒、(GNRs)-链霉亲和素的制备步骤为：