[发明专利]一种可提高分泌效率的信号肽及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种分泌能力提高的信号肽，特别是一种提高天冬酰胺酶活力的信号肽。

技术背景

L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH₃。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓细胞没有抑制作用。

L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。

一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia coli、Erwinia carotovora、Erwinia chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。

L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichia coli、Erwinia chrysanthemi、B.subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichia coli和Erwinia chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。

本发明基于枯草芽孢杆菌来源天冬酰胺酶基因在枯草芽孢杆菌中表达的平台，通过改造信号肽，实现的天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效表达，以期得到天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供一种可提高分泌效率的信号肽，核苷酸序列1）或2所示：

1）核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1序列如下：

ATGAAAAAAAGAAAGAGGCGAAACTTTAAAAGGTTCATTGCAGCATTTTTAGTGTTGGCTTTAATGATTTCATTAGTGCCAGCCGATGTACTAGCAAAATCTACA

2）对SEQ ID NO.1序列做出改造，但仍就行使信号肽功能且分泌效率未发生根本改变的核苷酸序列。

本研究通过融合信号肽，使天冬酰胺酶的分泌途径发生改变，转向SEC分泌方式，使天冬酰胺酶分泌量增加，酶活得到进一步的提高。

本发明还提供一株天冬酰胺酶分泌能力增强的枯草芽孢杆菌。

先前的工作中，本研究团队已将枯草芽孢杆菌168来源的天冬酰胺酶基因在枯草芽孢杆菌WB600中得到表达。基于枯草芽孢杆菌以构建好的平台，通过融合信号肽，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的新菌株；所述信号肽融合到需要表达基因的N端。

本发明所用到的培养基：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；

枯草芽孢杆菌发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L，玉米浆15g/L，尿素3g/L，葡萄糖40g/L，磷酸氢二钾2.3g/L，磷酸二氢钾1.7g/L，硫酸镁0.75g/L，氯化钠5g/L；调节pH6.8-7.0。

本发明中天冬酰胺酶酶活力的测定:

采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活。1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活定义：在37℃反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放1μmol NH₃所需要的酶量为一个酶活单位（U/ml）。酶活测定条件：37℃条件下，1ml10mM K₂HPO₄-KH₂PO₄（PH7.5），0.1ml189mM天冬酰胺，0.3ml发酵上清液，保温30分钟，0.1ml1.5M TCA终止反应。利用Shimadzu UV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。