[发明专利]一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法、及其制备的细胞系和应用

说明书

本发明提供了一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法，该方法包括：（1）复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的该哺乳动物细胞，用胰酶消化；（2）用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的哺乳动物细胞，连续培养该哺乳动物细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及（3）重复步骤（2）中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量，直到该无血清培养基中血清添加量为0，得到该悬浮培养的哺乳动物细胞。本发明的方法解决细胞获得均衡的营养，保证了疫苗的稳定性和均一性，同时取得了血清添加产生副作用的问题，使遭受外源污染的风险降低，且降低了动物的应激反应，也使得后续处理简单易行。

技术领域

本发明涉及一种适应单细胞纯悬浮无血清培养的哺乳动物细胞系的驯化方法以及使用该方法制备的细胞系。

背景技术

哺乳动物细胞的培养经历了滚瓶-微载体的培养模式。培养模式的改进，不但更容易实现规模化生产，而且降低了后期纯化工艺的难度。

转瓶培养技术是传统的贴壁细胞培养方式，将细胞接种在旋转的圆筒形转瓶中，细胞贴附于玻璃壁四周，培养过程中转瓶在轴承上不断旋转，使细胞能够交替接触培养液和空气，实现细胞生长代谢的目的。

滚瓶培养工艺不能对培养液组分、pH以及DO等条件实时控制调整，无法保证细胞处于最佳的生长状态，不能实现工业的大规模生产；滚瓶培养工艺繁琐复杂，周期长，劳动强度大，占地空间大，费时费力，且批次间差异较大，生产质量难以控制，产品质量不稳定。

微载体培养技术成为目前大规模培养应用较多的一项工艺，常使用的载体有两种，一种是片状载体，一种是球状载体。细胞在载体表面呈现单层生长，实现了在相当少的空间生产高密度的细胞和细胞产物。

微载体的价格昂贵，生产成本高，对动物疫苗生产不适合。而且微载体培养细胞过程中需要添加一定量的血清，不利于流感病毒的增殖；血清添加产生的副作用较大，后期纯化工艺困难。此外，培养基中添加了动物源血清使得在病毒培养或疫苗生产中遭受外源污染的风险大大提高，并且生产成本提高。

流感病毒疫苗的制备经过了从动物组织器官到细胞培养的规模化发展过程，流感病毒的培养经历了从鸡胚到哺乳动物细胞的发展过程，因此，基于以上考虑，开发出一种适合流感病毒无血清纯悬浮培养制备流感疫苗工艺具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种适应单细胞纯悬浮无血清培养的哺乳动物细胞系的驯化方法以及使用该方法制备的细胞系。

本发明的主要目的在于提供一种制备无血清培养的悬浮哺乳动物细胞系的方法，所述方法包括：（1）复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的所述哺乳动物细胞，用胰酶消化；（2）用添加了一定量血清的无血清培养基培养所述贴壁培养的哺乳动物细胞，连续培育所述哺乳动物细胞至适应所述添加了一定量血清的无血清培养基；以及（3）重复步骤（2）中的所述连续培育程序，逐渐降低所述无血清培养基中的血清添加量，直到所述无血清培养基中血清添加量为0，得到所述悬浮培养的哺乳动物细胞。

优选地，所述步骤（1）中的哺乳动物为MDCK细胞。

优选地，所述步骤（2）和（3）中的所述无血清培养基包括VP-SFMAGT^TM、MDCK细胞无血清无蛋白化学培养基、InVitrus^TM、或SFM4MegaVir^TM培养基以及在所述步骤（3）中当血清添加量为1%及以下时，所述无血清培养基还包括添加成分Pluronic F-68和硫酸葡聚糖。

优选地，所述步骤（2）中所述血清添加量为5%；所述步骤（3）中所述逐渐降低的血清添加量分别为3%、1%、0.5%、0%。

优选地，所述步骤（2）和（3）中的连续培养所述哺乳动物细胞至适应所述添加了一定量血清的无血清培养基的程序为连续培养3～5代。