[发明专利]一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种土壤滑刃属食真菌线虫的富集培养方法。

背景技术

土壤中栖居的线虫以自由生活线虫占绝对优势，而土壤自由生活线虫又以食细菌线虫和食真菌线虫为主（两者统称为食微线虫），约占自由生活线虫的80%。很多研究表明，食微线虫通过捕食土壤微生物，加速微生物繁殖，并通过代谢分泌和释放微生物所固持的养分，进而影响土壤生态过程和植物生长。但这种作用会因不同的线虫、微生物和植物的种类以及土壤基质的C/N营养状况而异。目前，关于土壤食真菌线虫与真菌的相互作用及其对植物生长的报道较少，尤其是污染土壤中的相关研究更是罕见报导。该类研究可以深入研究土壤食真菌线虫的取食习性及其取食行为在土壤食物链和整个土壤养分循环中的重要地位，而纯培养的土壤食真菌线虫是研究的基础。诸多研究表明滑刃属食真菌线虫（Aphelenchoidessp.）对土壤污染具有较强的耐性，广泛存在于各类污染土壤中，对其深入研究具有重大的意义。但是，目前鲜有关于土壤食真菌线虫尤其是滑刃属食真菌线虫的富集培养方法。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种富集培养滑刃属食真菌线虫（Aphelenchoidessp.）的方法，该方法简单易用，滑刃属食真菌线虫的繁殖率高，可为高效制备大量纯培养的滑刃属食真菌线虫提供技术保障。

本发明提供的一种富集培养滑刃属食真菌线虫的方法，具体步骤如下： 

1、滑刃属食真菌线虫（Aphelenchoidessp.）的分离：从野外采集新鲜土壤。采用改进的浅盘法从土壤中分离线虫。

2、滑刃属食真菌线虫（Aphelenchoidessp.）的鉴定：将烧杯中液体转入培养皿，然后根据滑刃属食真菌线虫的特征在解剖镜下用毛细管挑出该属线虫，再将其在光学显微镜下进行活体鉴定。

3、滑刃属食真菌线虫（Aphelenchoidessp.）的表面消毒：将线虫转入灭菌的离心管中，用硫酸链霉素和放线菌酮混合液对线虫进行表面消毒；

4、滑刃属食真菌线虫（Aphelenchoidessp.）的富集培养：将真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，采用封口膜（Parafilm）将培养皿封口，以防止培养基水分蒸发与污染。然后将培养皿倒置放于恒温培养箱，20-25℃黑暗培养，一周后，待灰葡萄孢大量繁殖时即将滑刃属线虫接入长满均匀一致灰葡萄孢的培养皿中。采用封口膜（Parafilm）将培养皿封口，培养皿正面朝上放入大小合适的灭菌整理箱内，20-25℃黑暗培养，定期观察培养皿是否受到其他真菌或者螨虫的污染，几个星期后，灰孢基本消失，线虫大量繁殖。重复以上步骤可获得大量的滑刃属食真菌线虫。其中，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配方为：每1000 ml马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，土豆190-220 g，葡萄糖18-20 g，琼脂15-20 g，其余为水，pH值自然。

上述步骤（1）所述的改进的浅盘法所需设备简单，操作易行，具体如下：将10目的不锈钢筛盘放入配套的浅盘中，在筛盘上放置两层面巾纸，然后把土样均匀铺在纸上，往浅盘中加水直至浸没土壤。再置于25℃温度、黑暗条件下分离。48 h 后，用400目筛收集线虫于烧杯中。静置过夜后，用真空泵缓慢吸取上层液体，尽量避免扰动下层液体。此时，下层液体聚集了大量的线虫。

上述步骤（2）中滑刃属食真菌线虫的主要鉴定特征如下：①热杀死后，雌虫虫体直到腹弯，雄虫通常尾部向腹部弯成钩状整个虫体呈“J”形（如果活体无法鉴定，可将其杀死后确定，为活体鉴定提供参考），活体线虫多呈“S” 形；②头部通常略缢缩，头架骨软化，口针较细，基部膨大，长度通常为10-12 μm，一般不超过20 μm；③食道前体部圆柱形，中食道球发达、卵圆形或者方圆形，中食道球瓣发达，后食道腺叶发达、覆盖肠的背面；④排泄孔位于中食道球后水平处；⑤雌虫尾呈圆锥形，尾端形态多样：钝圆或细圆，指状或分叉或有一腹突，有或无尾尖突，尾尖突的形态多样；⑥雄虫尾呈圆锥形、向腹面弯成钩状；交合刺呈玫瑰刺形，基顶和基喙通常发达，无交合伞。

上述步骤（3）中，所述混合液中，硫酸链霉素的质量-体积浓度为0.80-1.20 g.L^-1；放线菌酮的质量体积浓度为0.015-0.02 g.L^-1；对线虫进行表面消毒的时间为15-20 min。