[发明专利]一种查找与杆状病毒PCNA相互作用蛋白的方法

说明书

技术领域

   本发明涉及基因工程和生物技术领域，具体涉及与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）的增殖细胞核抗原（PCNA）相互作用的蛋白。

技术背景

杆状病毒是一类专门寄生于节肢动物的病原微生物。在杆状病毒众多成员中，研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)。杆状病毒宿主域很狭窄，仅限于少数几种节肢动物，主要是昆虫。杆状病毒用于生物防治的突出优点是： 对人畜安全， 不伤害天敌，对宿主致病性强，杀虫的后效作用较持久，不污染环境，并有后效作用。但其过高的宿主特异性与缓慢的发病致死作用也在一定程度上影响了杆状病毒的使用。通过基因工程构建重组病毒，不仅可以克服杆状病毒的固有缺点，也为扩大病毒杀虫功能提供了潜在可能。

增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的相对分子质量为29KD的酸性蛋白，它是一种表达水平随着细胞周期波动的高度保守的生长调控蛋白，可围绕DNA链组装成三聚体滑动夹。滑动夹PCNA能够以一定的秩序与多种复制相关蛋白如SSB（single-stranded DNA binding protein）、RFC(复制因子C)等结合，实现对DNA的复制、损伤修复、细胞周期调控及凋亡等事件的协同。因此，PCNA作为一个平台与DNA代谢中的多种蛋白因子相互作用，对于了解病毒的DNA修复机制非常有意义，为进一步研究和改造杆状病毒奠定了重要的生物学基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种查找与杆状病毒PCNA相互作用蛋白的方法,以实现对与PCNA起互作反应的蛋白的鉴定及功能分析。

为了解决以上技术问题，本发明应用分子克隆、DNA测序等手段克隆了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）PCNA基因的全长DNA，并对其纯化，耦连到亲和层析柱，与质谱连用查找互作蛋白，具体技术方案如下：

一种查找与杆状病毒PCNA相互作用蛋白的方法，其特征在于查找与AcMNPV即苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的PCNA即增殖细胞核抗原相互作用蛋白的方法，具体包含以下几个步骤：

步骤一，克隆所述AcMNPV的PCNA基因连接到表达载体中；所述PCNA基因为GenBank ID：1403881；

步骤二，在大肠杆菌Bl21中表达PCNA蛋白，通过Ni-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q离子交换层析柱纯化，得到PCNA高纯蛋白；

步骤三，利用所述PCNA高纯蛋白与CNBr-Activated Sepharose 4B耦连，制备PCNA亲和层析柱；

步骤四，在所述AcMNPV病毒感染SF9细胞后，收集感染后的总蛋白，经过PCNA亲和层析柱洗脱，SDS-PAGE鉴定洗脱组分，质谱鉴定与PCNA相互作用的蛋白。

所述的PCNA基因是用以下引物扩增得到的：

正向为5’-CGCGGATCCATGTTCGAAGCGGAATTT-3’；

反向为5’-CCGCTCGAGGTGATGGTGATGGTGATG-3。

步骤二中所述的纯化，具体过程为：收集的经超声波裂解、高速离心后含表达了PCNA蛋白的上清，经过Ni-NTA Agarose柱子和FPLC Mono Q离子交换层析柱分离纯化出高纯度的PCNA高纯蛋白。

步骤三中所述亲和层析柱的具体制备过程为：

过程一，如步骤二所述制备PCNA高纯蛋白；

过程二，制备亲和层析介质：耦连缓冲液，含有0.5M NaCl的pH8.3 0.1M NaCO3；称取CNBr-Activated Sepharose 4B冻干粉放置在1mM HCl中悬浮溶胀，放置大约30分钟后，弃滤液，用约15倍胶体积的1 mM HCl溶液冲洗干净；加入PCNA的含量为2 mg/ml的耦连缓冲液，4℃，过夜；将反应完洗涤过的凝胶悬浮到水中，加入1M乙醇胺，在常温最少搅拌反应2小时，以消除残余活性基团；用含有0.5M NaCl的0.1M PH为4.0的醋酸盐缓冲液和含有0.5M NaCl的0.1M PH为8的Tris-HCl缓冲液交替洗涤，重复洗涤3次即得亲和层析柱。