[发明专利]一种假丝酵母菌及一种微生物代谢制备D-缬氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及D-缬氨酸的制备，更具体地说，涉及一种基于微生物代谢制备D-缬氨酸的方法。

背景技术

目前市场上的D-缬氨酸主要是由化学法生产、酶拆分法生产，通过手性柱分离或者是采用氨基酰化酶拆分N-乙酰DL-缬氨酸的工艺，经浓缩、醇析、除盐、水解、精制、烘干得到D-缬氨酸。采用化学法生产的D-缬氨酸成分中其阈值不高，只能达到95%左右，同时生产过程中会采用大量的化学试剂，不仅成本高，收率低，同时生产过程中会产生大量的有机物、无机盐、固废和有机废水，对环境不友好。微生物不对称降解的原理生产D-缬氨酸不仅阈值高，收率高、生产成本低，而且采用的生物技术是国家鼓励类的生产工艺。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种以DL-缬氨酸为原料及反应底物生产D-缬氨酸的生物方法，利用假丝酵母代谢DL-缬氨酸中的L-缬氨酸制备得到纯度为99.5-99.9%D-缬氨酸，具有生产过程简单、条件温和、生产过程无污染、产品纯度高的特点。

为了达到上述目的，本发明提供一种微生物有氧发酵生产D-缬氨酸。首先本发明提供了一种假丝酵母菌（Candida sp.）DLPU-D-Val，，保藏编号为CGMCC NO.7786。

本发明还提供了利用假丝酵母菌DLPU-D-Val制备D-缬氨酸的应用。

具体说，本发明一种微生物代谢制备D-缬氨酸的方法，向含有DL-缬氨酸的发酵培养基中加入假丝酵母菌体DLPU-D-Val进行有氧发酵，制得到D-缬氨酸；所述假丝酵母菌体DLPU-D-Val保藏编号为CGMCC NO.7786。

优选方式下，以体积质量百分比计所述发酵培养基成分：6-8%DL-缬氨酸，0.1～1.0%的葡萄糖或蔗糖或麦芽糖，0.2～2.0%的蛋白胨，酵母膏0.2～1.5%，0.2～0.5%磷酸氢二钾，0.3～1.0%磷酸二氢钾，0.05～0.15%硫酸镁，0.005～1.0%氯化钙，5.0～10毫克每升三氯化铁，4.0～8.0毫克每升硫酸锌。

发酵过程：将菌体加入发酵培养基中，30～32℃、300～400rpm下进行有氧发酵，过程中每隔2-4小时调节pH，使其pH维持在6.0-6.2之间，144-168小时pH不再上升时结束；发酵结束后，发酵液80-90℃杀菌30-40分钟。用离心机离心发酵液，去除菌体，发酵清液用0.5-1.0%活性炭在90-100℃脱色30-40分钟，脱色液减压浓缩，真空度大于-0.085MPa,待浓缩液中出现大量晶体时，停止浓缩，冷却到室温，抽滤，湿晶体用甲醇漂洗，90-100℃烘干得D-缬氨酸成品。

上述发酵过程中调节pH选用10%硫酸。

此外本发明还提供了假丝酵母菌体的活化获取方法，包括如下步骤：

1、配制斜面培养基，以体积质量百分比计包括：0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%琼脂粉；121℃灭菌30min；

2、将假丝酵母菌种接入所述斜面培养基中30℃、300～400rpm的条件下培养24～28h，离心取菌体。

本发明是利用从土壤中筛选出的一株假丝酵母制备高纯度医药级D-缬氨酸的方法，属发酵工程领域。。该菌株具有不对称降解能力，利用微生物不对称降解的原理，通过微生物降解DL-缬氨酸中的L-缬氨酸而不降解D-缬氨酸，再在发酵液中提纯制备D-缬氨酸。本发明方法成本较低，过程简单，可用于大规模生产。本发明摒弃传统的化学方法，不使用有机溶剂，无废水、盐和固废产生，是一种绿色生产工艺。

保藏说明

本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物（株）为DLPU-D-Val，分类命名为假丝酵母（Candida sp.），于2013年6月13日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏编号CGMCC NO.7786。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

本发明提供了一种过程简单，成本较低，利用DL-缬氨酸生产高纯度D-缬氨酸的生产方法。具体通过以下技术方案实现：

从土壤中筛选出可以代谢L-缬氨酸而不利用D-缬氨酸的假丝酵母（Candida sp.）DLPU-D-Val，保藏号为CGMCC No.7786（以下简称7786）。

配制斜面培养基（培养基中的成分以体积质量百分比计）：0.5%葡萄糖，1.0%蛋白胨，1.0%酵母膏，2%琼脂粉，121℃灭菌30min。