[发明专利]高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物、探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)的检测引物、探针及检测方法。

背景技术

猪蓝耳病病毒(PRRSV)是单链RNA病毒，基因组全长15kb，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸综合症”，该病毒可引起成年猪繁殖障碍、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常，是一种高度传染性疾病。1987年猪蓝耳病首次在北美发现，现已席卷全球，成为危害性最大的猪传染性疾病之一。猪蓝耳病病毒可以分为两种基因型，即以VR-2332株为代表的美洲型毒株和以Lelystad virus(LV)代表的欧洲型毒株。高致病性猪蓝耳病是由高致病性猪蓝耳病病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HP-PRRSV)引起的一种急性高致死性传染病，于2006年在中国首次发现；发现的当年在中国感染了200万头猪，死亡率达到20%。序列分析表明，HP-PRRSV在非结构蛋白2（NSP2）编码区内存在一段不连续的30个氨基酸的缺失。

目前，检测猪蓝耳病病毒的方法包括病毒的分离和培养，酶联免疫吸附(ELISA)等，但这些方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。反转录PCR(RT-PCR)技术由于灵敏性和特异性较高，已经成为猪蓝耳病检测的常用方法。但常规RT-PCR需要进行后续电泳鉴定，易发生交叉污染而产生假阳性，且操作耗时较长。相比之下，荧光定量PCR技术（real-time RT-PCR）具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交叉污染并提高检测效率。

然而，目前基于RT-PCR检测蓝耳病的方法都要进行病毒RNA提取，然后以RNA为模板进行检测；这一RNA提取步骤无疑大大增加了检测工作量、时间和成本，难以实现高通量检测；此外，提取RNA的过程仍容易发生RNA降解或交叉污染等事件；且对于痕量样本，提取RNA仍存在较大困难。

因此，现有的基于RT-PCR检测蓝耳病的方法还有待于改进和发展。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，以及该检测方法所使用的引物和探针。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物，所述检测引物如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。

一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测探针，所述检测探针如SEQ ID No:3所示。

一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，使用上述检测引物和检测探针进行检测，包括以下步骤：

将血清样本直接加至荧光定量RT-PCR反应体系中，进行荧光定量RT-PCR，反应结束后检测PCR产物中是否含有高致病性猪蓝耳病病毒；其中，

所述荧光定量RT-PCR反应体系为：

所述荧光定量RT-PCR的反应程序为：55±1℃反应30min，95℃反应5min;94℃变性30s，60±1℃退火/延伸40s，反应35～45个循环。

在其中一个实施例中，所述RT-PCR反应体系为：

在其中一个实施例中，所述荧光定量RT-PCR的反应程序为：55℃反应30min，95℃反应5min;94℃变性30s，60℃退火/延伸40s，反应40个循环。

本发明提供了一种无需提取病毒RNA就能直接用检测血清中高致病性猪蓝耳病病毒的直扩RT-PCR方法。该直扩RT-PCR技术由于具有以下几点特别之处而实现了无需从血清中提取病毒RNA的目的，从而有效克服了传统RT-PCR技术需要提取RNA而带来的操作繁琐、提取困难、交叉感染、容易降解等诸多难题：

1、本发明使用了一种高耐受性DNA聚合酶