[发明专利]大豆胚尖生长点转化方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种利用针头创伤大豆胚尖顶端的农杆菌介导的抽真空辅助转化大豆的遗传转化方法，属于大豆转基因研究领域。

背景技术

大豆「Glycine  max (L.)Merr.」原产我国，世界最大的油料作物,因为大豆不仅可粮用、油用和饲用,还是植物蛋白的主要来源,又是食品、饲料等多种加工工业的优质原料。然而在普通栽培过程中，其产量和品质易受各种病虫害的影响。一直以来人们尝试用基因工程手段改良大豆种质，使其抗逆性增强。现如今抗草甘膦转基因大豆已经成为美国、阿根廷内种植面积较大的国家，全世界有200多个公司在触手适应不同气候和地区、不同生育期的抗草甘膦大豆品种。然而，在我国暂时还未得到推广，就我国国情而言，培育出具有自主知识产权的转基因大豆迫在眉睫。

然而，大豆遗传转化一直受到诸多因素的限制，自1984年大豆遗传转化的首次报道。近30年的研究，大豆遗传转化效率依旧没有显著提高。其限制原因主要集中在两方面，一是大豆组织培养再生体系，现如今大豆再生体系分为器官发生途径和体细胞胚发生途径，二者普遍存在着再生率低、重复性差、基因型差异较大等问题，从而影响了后期遗传转化方面的工作；二，大豆遗传转化方面，遗传转化依赖良好的再生体系，同时大豆本身是一年生有性生殖植物，外源基因的嵌合体、稳定遗传等问题严重影响了转基因大豆的遗传效率。目前，我国大豆转化常用的外植体如子叶节、胚尖、下胚轴等，转化方法为基因枪轰击转化法和农杆菌介导转化法，然而二者均存在转化周期长、转化率第低、嵌合体严重等问题。

本研究取材方便、快捷，无需组织培养阶段，无需严格灭菌，再生能力强、操作简单、生长周期短，是良好的遗传转化受体系统，对大豆遗传转化研究有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆胚尖生长点转化方法，即利用针头创伤大豆胚尖生长点，农杆菌介导，真空渗透辅助外源基因导入，带一片子叶的胚尖改良转化方法。其特征是利用萌发2~3天的大豆种子，去掉种皮、一片子叶及真叶，暴露生长点后，用蘸有农杆菌菌液的针头轻轻的于生长点处刺划几下，利用农杆菌真空渗透法辅助侵染大豆胚尖，吸去表面菌液后，共培养至长出0.5mm芽时，接转到营养土中培养，获得92%的再生率， F1代检测转化率为6%。

本发明主要技术方案如下：

1、农杆菌菌液制备

在超净工作台中，用无菌移液器从 LB 培养平板上挑取携带有目的基因质粒的农杆菌单菌落接种于含有抗生素的 LB或YEP液体培养基中， 28℃，200 r/min振荡培养14-16小时，然后以1：50进行2次活化，培养至 OD600 =0.5~0.7左右，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25℃离心10min收集菌体，重悬液重悬菌体，按1:10~1:20的比例浓缩菌体，制备好的工程菌液备用。

重悬液：1/2 MS+60 g/L蔗糖+100μmol/L AS（乙酰丁香酮），pH5.5。

2、大豆外植体的获得

     挑取种皮完整、无病斑且干燥的成熟大豆种子，用氯酸钠：浓盐酸=10：1在乐扣杯中制造氯气，灭菌4-6h，通风橱中使氯气散尽，于超净工作台中，在加有8mL无菌水的带有2张滤纸的9cm平皿中放入15粒大豆种子。25-28℃黑暗环境中萌发2~3d 。

取胚根萌发至0.5~2cm的大豆种子，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，小心去掉一片子叶和所有原叶，暴露胚尖顶端，自然条件下稍微晾干，用沾有农杆菌菌液的针头顶端轻轻划刺2~3下，然后将预处理好大豆胚尖放入制备好的农杆菌菌液中。

3、真空渗透辅助侵染与共培养

将预处理好的大豆胚尖放入预先制备好的工程菌液中，使菌液与大豆胚尖充分接触，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟；将大豆胚尖取出，吸取表面菌液，放入灭好菌的带有2层滤纸的平皿中，每皿放置8粒，加入2~3mL无菌水，25-28℃黑暗环境中暗培养；3天后，向平皿中加入5~10mL无菌水，25-28℃光照环境下培养，直至胚尖顶端伸长至0.5~1cm，此时真叶也开始出现。

按营养土：蛭石：珍珠岩=6：4：1比例混合土壤，将土装入直径5cm的黑色塑料软质小花盆中，将幼苗种入花盆中，注意不能折断大豆根部，充足浇水，光照培养至4-6 片叶片长出后，移栽至大田或大型花盆中，直至开花、接种后，收集种子。

4、筛选，PCR检测