[发明专利]一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，涉及一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法。 

背景技术

动物胴体肌肉和脂肪组织的比例及其结构与分布，是决定肉用动物生产性能和肉品质的主要因素。一般来说肌肉组织主要由骨骼肌细胞组成。脂肪组织又可分为皮下脂肪、内脏脂肪和肌内脂肪，不同部位脂肪沉积主要依赖于脂肪前体细胞的增殖、分化和聚脂成熟。其中肌内脂肪是有益脂肪，是形成大理石纹肉的物质基础，直接参与了肉质嫩度、多汁性和肉品风味的形成，是影响肉质风味的重要因素。过去20年里，国内外学者利用细胞系如3T3-L1前脂肪细胞系和不同动物如鼠、人、猪等皮下脂肪在细胞水平上对脂肪细胞分化过程进行了研究并已取得了一定成果。但由于肌内脂肪是夹杂在肌肉组织中的少量组织，以难和肌肉组织分离，数量少等原因而很少得到分离和研究。而有关骨骼肌细胞的研究则主要以小鼠肌细胞系C2C12为实验材料，大型哺乳类动物骨骼肌细胞的分离和研究也相对较少。 

随着对动物发育规律的不断研究和认识，人们发现动物体内的肌肉和脂肪其实在动物发育过程中处于一个动态平衡状态。前体脂肪细胞可以分化为成熟脂肪，而成熟脂肪也可以去分化为前体脂肪甚至可以向肌肉细胞转分化；同样，在某些特殊的条件下肌肉祖细胞也可以分化为脂肪细胞。另外，脂肪细胞分泌的细胞因子可以通过旁分泌和自分泌作用影响肌细胞的成长，而肌细胞分泌因子也影响脂肪细胞。因此，将脂肪细胞和肌细胞单独培养只能观察到各自的独立事件，而无法研究它们之间的相互作用。 

以上阐述可以得出，和皮下脂肪相比，肌内脂肪细胞的分子事件更值得研究，这就需要一个纯度高的肌内脂肪细胞模型，同时，要想了解肌内脂肪细胞和肌细胞之间的关系，则需要将两种细胞在相同环境条件下同培养，使其分泌的细胞因子相互作用，这样，才能更好的模拟动物体内环境。所以本发明创新的将动物同一肌肉组织的肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞在同一培养液中单独而又共培养，既可以单独分析脂肪细胞分化去分化事件，或肌细胞发育机制，又可以研究两种细胞之间的相互作用，加之方法简单可操作，培养设备要求低，是一种很好的细胞培养模型，具有一定的研究推广价值。 

发明内容

本发明的目的是解决哺乳动物肌内前体脂肪细胞难分离、杂细胞多等问题，同时解决两种细胞分层独立而又共培养的难题，提供一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法，为研究细胞间的相互作用提供细胞模型。 

一种哺乳动物肌内脂肪细胞和骨骼肌细胞分层共培养方法，包括以下步骤： 

1）取动物背最长肌，肌内脂肪丰富的肌肉样组织，除去可见的血管和结缔组织，用PBS缓冲液冲洗； 

2）在无菌条件下将组织剪成小块，加入浓度为1g/LⅠ型胶原酶消化液消化； 

3）消化结束后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基等体积中和消化液，用孔径为250μm的尼龙网筛过滤细胞悬液； 

4）步骤3）的滤液经900～1200r/m离心8～15min，取离心后的顶层悬浮成熟脂肪细胞液加入25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂培养箱中静置培养；所述的25cm²培养瓶需预先灌满含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中静置孵育4～6小时，使培养瓶内保持均衡； 

5）取上一步离心的下层细胞加红细胞裂解液洗涤，轻轻吹打以裂解红细胞，作用3～8min后900～1200r/m离心3～8min；倒掉上层离心液，加无血清DMEM/F12培养基稀释洗涤下层细胞，再用孔径为80μm的尼龙网筛过滤，收集滤液，1000r/min离心5min；倒掉上层离心液，加入500μL含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打分散细胞后接种于装有含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的直径为3.5cm培养皿中,置含37℃、5％CO₂培养箱中静置培养； 

6）接种后2～3小时，取出细胞培养皿，轻轻吹打培养皿的底部,吸出含肌细胞的培养液,转移到步骤入4）中的25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养细胞；这一步骤的原理是脂肪前体细胞贴壁比骨骼肌细胞快，所以2～3小时后脂肪前体细胞会贴壁在培养皿底部生长，不用胰酶消化是不会下来的，而轻轻吹打培养皿的底部,吸出来的培养液中几乎只含骨骼肌细胞；