[发明专利]一种以吡唑啉为母体的还原型谷胱甘肽荧光探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光探针，尤其涉及一种以吡唑啉为母体的还原型谷胱甘肽荧光探针。

背景技术

吡唑啉衍生物具有较大摩尔消光系数和较高量子产率，常常修饰后用于荧光探针，并用作标记生物分子。近几年，利用荧光增强效应检测活体细胞中还原型谷胱甘肽的研究得到不断发展。

谷胱甘肽是细胞内最多的非蛋白巯基，在维持细胞生理功能中起着重要作用，包括细胞内的氧化还原反应，异物代谢，细胞内的信号传导与基因调控。更具体地说，谷胱甘肽是细胞内最多的小分子生物硫醇（1-10mM），并且还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽之间存在着一个氧化还原平衡。研究发现，还原型谷胱甘肽在细胞的生长，和维持细胞正常功能的氧化还原平衡中起着关键的作用。此外，人体中谷胱甘肽浓度异常与癌症、阿尔茨海默氏症和心血管等疾病有关。因此，生物和环境样品中生物分子硫醇的检测始终吸引着科学家们极大的兴趣。已授权的专利【CN200710065564.3】、【CN200810020777.9】和【CN201010558433.0】中可以实现选择生物体中的活性硫醇，但是缺乏对还原型谷胱甘肽的专一性。经检索，利用合成的2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯作为还原型谷胱甘肽荧光探针的应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种以吡唑啉为母体的还原型谷胱甘肽荧光探针。

本发明所述的以吡唑啉为母体的还原型谷胱甘肽荧光探针，其特征在于：所述探针是2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯，其结构式如式（I）所示：

上述2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯由如下方法制得：

将1-(2-羟基苯基)-3-苯基丙-2-烯-1-酮与苯肼反应得到2-(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯酚，然后与丙烯酸酰氯反应得到2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯。

上述2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯作为还原型谷胱甘肽探针的应用。

本发明所述的2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯可以与还原型谷胱甘肽发生迈克尔加成反应生成具有荧光性质的吡唑啉谷胱甘肽产物。

配制2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（20mM PBS，pH=7.4，3:7，体积比）的溶液，分别定量加入微升级的Cys,Hcy,GSH,Arg,Asp,Glu,Gly,His,Lys,Ser,Thr,Trp,Tyr,Val，KNO₃,Ca(NO₃)₂,NaNO₃,Mg(NO₃)₂,Zn(NO₃)₂,Fe(NO₃)₃,过氧化氢和葡萄糖的水溶液。通过荧光分光光度法测试对不同氨基酸、人体常见金属离子、还原型谷胱甘肽、双氧水和葡萄糖的选择性和响应能力。结果显示2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯衍生物对还原型谷胱甘肽具有很好的选择性，加入还原型谷胱甘肽前后对照显示具有很强强荧光增强效应。见图1。

本发明设计合成的2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯可以与还原型谷胱甘肽发生加成反应生成具有荧光性质的物质，从而可以专一性的选择还原型谷胱甘肽，把还原型谷胱甘肽与半胱氨酸、同型半胱氨酸进行区分。明显提高了其作为荧光探针检测活体细胞中还原型谷胱甘肽高选择性和高灵敏度，实现对还原型谷胱甘肽的微量检测。

本发明提供的2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯能使膜渗透性增强，而且低毒抗荧光漂白。

附图说明

图1为2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（20mM PBS，pH=7.4，3:7，体积比）的溶液加入不同的氨基酸、常见金属离子、双氧水、葡萄糖和还原型谷胱甘肽的荧光发射图谱。

图2为2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯的核磁共振氢谱。

图3为2–(1,5-二苯基-4,5-二氢-1H-吡唑-3-基)苯基丙烯酸酯的核磁共振碳谱。