[发明专利]产卡那霉素B工程菌及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物制药、基因工程与微生物分子遗传学技术领域，针对产业化中的科学技术难题，引入交叉学科技术和微生物分子遗传学技术，解决生产过程中的关键技术瓶颈，涉及一种主产卡那霉素B基因工程菌及其构建和应用，达到低耗，高产，稳产，环保，洁净和高质的效果。 

背景技术

卡那霉素B（Kanamycin B）是一种重要的氨基糖苷类抗生素，具有很强的抑杀菌能力，且对金黄色葡萄球菌的作用明显优于头孢菌素、四环素以及青霉素等抗生素。但其耳肾毒性较高，且易于被氨基糖苷类钝化酶钝化，从而限制了卡那霉素B在临床上的应用。为了克服这些缺陷，日本科学家梅泽等对卡那霉素B进行了结构改造，脱去卡那霉素B中的3′位和4′位羟基，得到地贝卡星（Dibekacin，3′, 4′-双去氧卡那霉素B），地贝卡星不仅保留了卡那霉素B的抗菌活性，且抵制氨基糖苷类钝化酶攻击的能力明显强于卡那霉素B，在临床上得到广泛应用。梅泽等人进一步在地贝卡星的C1位氨基上引入α-氨基-γ-羟基丁酸侧链，得到阿贝卡星（Arbekacin）。阿贝卡星的耐钝化酶能力更强，耳肾毒性更低，对许多耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌有效。因此，卡那霉素B是制备半合成抗生素阿贝卡星及其中间体地贝卡星的重要原料（图1）。 

目前工业上使用的卡那霉素B主要从卡那链霉菌发酵液中分离得到。但卡那链霉菌发酵产物的主要组分为卡那霉素A，卡那霉素B的含量较低，且这两种组分结构相似，导致卡那霉素B的提取精制十分困难，价格昂贵，无法大规模生产，从而大大束缚了阿贝卡星与地贝卡星的开发应用。卡那霉素B也可通过氨甲酰卡那霉素B水解制得，氨甲酰卡那霉素B是黑暗链霉菌发酵产物中的三种主要组分之一，但与其他两种主要组分（安普霉素和氨甲酰妥布霉素）相比，氨甲酰卡那霉素B产量很低。从发酵调控提高氨甲酰卡那霉素B产量非常困难[Irina Borodina, Charlotte Scho¨ller, Anna Eliasson, and Jens Nielsen. Metabolic Network Analysis of Streptomyces tenebrarius, a StreptomycesSpecies with an Active Entner-Doudoroff Pathway. Applied and environmental microbiology , May 2005, p. 2294–2302]，因此，很难从发酵液中提取精制。此外，氨甲酰卡那霉素B与氨甲酰妥布霉素的理化性质也很相似，导致这两种重要药物的提取分离变得非常困难。因此，若从黑暗链霉菌发酵液中提取氨甲酰卡那霉素B，将面临着氨甲酰卡那霉素B含量过低与提取精制困难两大难题。 

此外，从氨甲酰卡那霉素B制备卡那霉素B，需要在碱性条件下经过高温热水解，去掉氨甲酰基，才能得到卡那霉素B。由于水解过程存在化学反应平衡问题，因此或多或少都存在部分氨甲酰卡那霉素B不能完全转化为卡那霉素B，因此要制备符合药品规定质量标准的卡那霉素B就变得非常困难。此外，碱性（pH10）高温水解不仅是高能耗过程，而且属危险性操作，还会破坏一定数量的卡那霉素B，产生二次副产物，给制备符合质量标准的卡那霉素B添加了更多的副产物。因此，碱性水解也是产业化中的无奈之举，成了生产过程的关键技术瓶颈。如果能从发酵法直接获得卡那霉素B，所有这些难题将迎刃而解。