[发明专利]一种可抑制褐变产生的川贝母多倍体愈伤组织的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种川贝母多倍体愈伤组织的培养方法，特别是涉及一种可抑制褐变产生的川贝母多倍体愈伤组织的培养方法

背景技术

川贝母（Fritillaria cirrhosa D.Don）是百合科多年生草本植物，以鳞茎入药，为名贵的川产道地药材，堪称药中之宝。川贝母是治疗肺热燥咳,干咳少痰,阴虚劳嗽,咯痰带血的常用药物，主要有效成分为贝母生物碱和甾体皂甙类等。在自然界中川贝母从种子萌发到长成药材，大约需要4-5年，由于川贝母价格昂贵，加之药材中有效成分含量很低，因此造成了川贝母野生资源的过度采挖，使得川贝母野生资源锐减，正面临枯竭的境地。

杨杨等人在《野生和组培川贝母总生物碱含量的测定和定位研究》的一文中报道了利用组织培养技术生产的川贝母愈伤组织其生物碱含量为0.146%，高于野生川贝母0.111%和市售的川贝母0.08%；王跃华等人在《卷叶贝母多倍体鳞茎诱导方法研究》一文中报道了通过利用秋水仙素诱导卷叶贝母产生的多倍体的愈伤组织培育出的多倍体鳞茎，其总生物碱含量为0.249%，大大高于二倍体组培鳞茎0.190%和市售卷叶贝母鳞茎0.068%。这是因为植物细胞中染色体数目加倍后，染色体上基因调控有效化学成分的含量也较正常二倍体增高，因此培育出的多倍体植物细胞中有效化学成分的含量也会明显增加。

虽然诱导产生的川贝母多倍体愈伤组织的有效组分含量大大提高，但川贝母多倍体愈伤组织在增殖培养过程中却极易出现褐变，严重的甚至会出现死亡。因此，如何有效地抑制川贝母多倍体愈伤组织在增殖培养中产生褐变的问题，将直接影响到利用生物技术大规模快速生产川贝母中有效组分的方法顺利实施。目前还未见有相关解决方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能有效抑制褐变产生的川贝母多倍体愈伤组织的培养方法。

为达到上述目的，本发明采用的解决方案包括如下步骤：

（1）川贝母多倍体愈伤组织的诱导培养：选取川贝母新鲜鳞茎的鳞片叶，先进行消毒处理，然后接入pH值为5.5～6.2的MS+6-BA0.1～1.0mg·L^-1+2，4-D1.0～5.0mg·L^-1+IAA0.1～1.0mg·L^-1+秋水仙素300～600mg·L^-1+蔗糖20～40g/L+琼脂5.0～6.5g/L的培养基中，在温度为12～20℃且无光照的条件下诱导培养2～5天，然后再转接到不含秋水仙素的上述培养基中，在同样的培养条件下进行培养，获得川贝母多倍体愈伤组织；

（2）川贝母多倍体愈伤组织的预处理：在超净工作台上将川贝母多倍体愈伤组织从培养瓶中取出，直接浸泡于装有柠檬酸溶液的培养皿中，并在柠檬酸溶液中将其切割为1.0cm～3.0cm³的大小后，转接入pH值为5.0的MS+活性炭1.0～4.0%+乳糖20～35g/L的液体培养基中，在温度为10～15℃、无光照和摇床转速为120～140r/min的条件下预处理4～8天；

（3）川贝母多倍体愈伤组织的快速增殖培养：将经预处理后的川贝母多倍体愈伤组织转接到pH值为5.5的改良MS+2,4-D1.0～4.0mg/L+KT0.5～2.0mg/L+二硫苏糖醇0.1～0.3mg/L+葡萄糖20～45g/L+琼脂4.0～5.0g/L的固体培养基中，在培养温度为12～26℃、每天光照4～8小时和光照强度为500～800lx的条件下进行增殖培养，所述改良MS基本培养基为无机物和硝酸钾含量减半的MS基本培养基。

上述步骤（1）中所述消毒处理是指先用洗衣粉洗净后于流水下冲洗25～30mim，再用2.0%次氯酸钠溶液漂洗12～15min，用清水洗净并吸干水后，再放入0.1%升汞溶液中消毒7～10mim，然后用无菌水冲洗2～3次后用无菌滤纸吸干表面的水分。

上述步骤（2）中所述柠檬酸溶液的浓度为0.1～0.5mg/L。

本发明通过采用将诱导产生的多倍体愈伤组织浸泡在柠檬酸溶液中切割为适当大小，再转接入由MS、活性炭和乳糖组成的培养基中进行预培养，然后将预培养后的多倍体愈伤组织接入以改良的MS为基本培养基，并添加了2,4-D、KT和二硫苏糖醇的固体培养基中进行增殖培养，有效克服了川贝母多倍体愈伤组织在增殖培养中易产生褐变的问题，提高了川贝母多倍体愈伤组织的增殖倍数，为利用生物工程技术大规模、快速生产川贝母有效组分提供了一条新途径。

下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1