[发明专利]两种细菌混合培养生产聚羟基脂肪酸酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用两株野生菌联合发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)-生物可降解塑料的方法。 

背景技术

塑料已成为国民经济中的第四大支柱产业。随着需求的不断增强，传统塑料过度依赖化石燃料，使用后难回收、难降解的弊端日渐凸显。同时，新疆作为一个农业大省每年需要大量的农膜和节水管材，这些产品目前多为化学合成产品，如果能用生物可降解塑料部分或全部替代它们，将对以后的耕作和作物生长极为有利。这就要求科研工作者开发新型的绿色塑料。 

聚羟基脂肪酸酯(PHA)是一类微生物积累的储存性聚酯颗粒。是在不平衡生长条件下胞内能量和碳源的储藏物质，自然条件下可完全生物降解。有氧条件下，PHA能完全降解成水和CO₂。在厌氧条件下，PHA能被微生物降解生成甲烷。作为一种潜在的环境友好型可生物降解塑料，其具有与聚丙烯(PP)相似的性质，因此成为近年来研究的热点。 

现阶段PHA合成发酵过程大多是利用纯种微生物、基因工程菌，生产原料主要是葡萄糖或者价格较昂贵的丙酸、戊酸等有机底物，高产菌株的寻找，底物的选择，设备的灭菌以及产物提纯都制约着PHA生产成本的降低。为了抵消高生产成本，应用领域还主要局限于医用器材，高档化妆品包装盒等高附加值产品。现在研究表明，利用多菌混合发酵生产PHA更有优势，不论是对经济方面还是环境方面。目前利用微生物混合发酵生产PHA的报道还较少，或单纯利用驯化的活性污泥进行发酵。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，这种方法可以丰富PHA的生产，降低无菌要求，使生产的PHA性能优越。 

本发明是通过以下技术方案得以实现的： 

通过实验，从新疆自然环境筛选出合成PHA的菌株，经形态观测及基因序列比对确定种属。 

两种菌(WN-H₄1和1175)混合发酵培养，优化发酵工艺。 

分离提纯产物，对其结构进行分析，做分子量、热性能和力学性能的测定。混合发酵产物与纯菌发酵产物进行比较。 

本发明的优点：目前生产PHA主要主要利用纯菌或重组菌。混合发酵也多限于驯化活性污泥。两种野生菌联合发酵产PHA的方法与纯菌／重组菌发酵相比，对杂菌的耐受性要强些，底物选择面广；与活性污泥发酵相比，目标菌种更明确，利于后续代谢研究。 

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明， 

实施例1：两株菌混合发酵 

都选择18h发酵的种子接种，发酵培养基为贫氮培养基。混合发酵先接种1175，发酵24h后接种WN-H₄1，(1175／WN-H₄1=1／2，总接种量为10％)，100mL／250mL锥形瓶，30℃，100r／min，总发酵时间72h。 

表1纯菌发酵与混合发酵的比较 

从试验结果可以看出，在原始培养基上，WN-H₄1＆1175混合发酵细胞干重分别是WN-H₄1和1175细胞干重的4.38和1.46倍；产物量分别是WN-H₄1和1175的2.76和0.92倍。说明这两种菌混合培养彼此不会发生拮抗作用，相反一株菌的中间代谢产物可能还会促进另一株菌的生长。而产物量与1175单菌发酵并没有明显降低，减少部分可能是因为能流分配。 

实施例2：混合发酵产物的GPC测定分子量 

对WN-H₄1、1175和WN-H₄1＆1175发酵提纯的三种产物都进行了渗透凝胶色谱分析，结果如下表2 

表2纯菌发酵与混合发酵提取产物的GPC 

从测试结果可以看出，WN-H₄1＆1175混合发酵合成产物的数均分子量比WN-H₄1和1175单独发酵合成产物的数均分子量都大一个数量级，且分散度仅为1.16。R.Rai在文章中汇总了多种mcl-PHAs产品的性质，其中Mn在2.52*10⁴至1.91*10⁵之间，PDI在1.7至4.4之间。我们混合发酵所得聚合物的PDI远小于R.Rai罗列的最小值，说明该聚合物的相对分子量均一性非常好。