[发明专利]一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒以及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种铜离子检测试剂盒，特别涉及一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒。

背景技术

环境中离子的浓度直接影响人们的健康，过高或过低都会影响人们的健康。在众多的离子中，重金属离子的危害性更大，因此有必要对其含量进行精确的测定。

传统的用于检测重金属离子的方法主要有石墨烯原子吸收光谱法（graphite furnace atomic absorption spectrometry，AAS）和电感耦合等离子原子发射光谱法（inductive coupled plasma atomic emission spectroscopy，ICP-AES）。这两种方法对于重金属离子的检测准确可靠，但使用的仪器价格昂贵，需要经验丰富的技术人员来操作，因而限制了其在基层实验室的广泛应用。近年来，各种检测重金属离子的生物传感器不断出现，其检测的原理都是依赖于重金属离子能够切割其DNA酶结合的底物链的特定位点，然后使用一系列的方法来检测释放的底物链，检测方法包括：荧光法，比色法，动力学光散射法和胶体金试纸条法等。

近年来，基于Cu⁺的点击化学由于其高效和特异性而得到了广泛的应用，它指的是一个分子的叠氮基团和另一个分子的炔基基团在Cu⁺的催化下，通过环加成反应形成一个三唑五元环而被连接在一起。并且，叠氮基团和炔基基团的之间的反应不受溶液中其它基团的干扰，特异性好。Cu⁺可以通过抗坏血酸钠还原Cu²⁺产生。基于Cu⁺的点击化学已经用于可视化检测Cu²⁺，其检测的原理多是基于观察胶体金溶液的变化来间接的反应Cu²⁺的浓度。但是，有些比色法需要通过改变反应温度才能观察到胶体金溶液的变化，并且，这些方法的灵敏度都有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，该试剂盒具有专门设计的能够形成G四聚体的富含G碱基的序列，可形成具有HRP活性的G四聚体，可用于Cu²⁺的浓度的定性和定量分析，检测体系简单，特异性好，不受其他物质的干扰，操作容易，反应迅速，检测结果可靠，适合在基层实验室使用。

本发明所述的一种基于点击化学和G四聚体的铜离子检测试剂盒，包括以下成分：两段G四聚体形成序列，第一序列G1为5’-GTGGGT AGG-N=N=N-3’，在其3’端修饰叠氮基团，第二序列G2为5’-CH≡CH-GCGGG TTGGG-3’，其’端修饰炔基基团；所述第一序列的叠氮基团和所述第二序列的炔基基团通过Gu⁺催化的环加成反应而连接形成一条G四聚体形成序列；抗坏血酸钠，粉末形式；PBS反应液，含有0.2M NaCl；高铁血红素，粉末形式；1M KCl；0.05%（w/v）H₂O₂；0.05%（w/v）四甲基联苯胺，即TMB；以及浓H₂SO₄，作为终止反应液。

本发明的另一目的还在于提供根据本发明所述的铜离子检测试剂盒的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测方法。

本所述的基于点击化学和G四聚体的铜离子检测方法，包括以下步骤：

1）将第一序列G1、第二序列G2、待检测样品和抗坏血酸钠先后加入PBS反应液中，混匀，20-25反应1小时，使G1的叠氮基团和G2的炔基基团通过Gu⁺催化的环加成反应而连接起来，形成一条G四聚体形成序列；

2）在上述反应液中加入高铁血红素和KCl，充分震荡反应，使高铁血红素和所述G四聚体形成序列形成具有HRP的活性高铁血红素/G四聚体结构；

3）在上述溶液中加入H₂O₂和TMB，所述高铁血红素/G四聚体能够催化无色的TMB形成有色的底物；

4）加入浓H₂SO₄终止反应，观察溶液颜色的变化；如果所述待检测样品含有Cu²⁺，溶液的初始颜色为无色，加入H₂SO₄后颜色变为黄色，黄色的深浅可以间接表明Cu²⁺的浓度；

5）将上述液体转移到酶标板中，使用酶标仪读取每个孔中的溶液在450nm处的OD值，对Cu²⁺的含量进行定量分析。