[发明专利]一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法有效
| 申请号： | 201310466108.5 | 申请日： | 2013-10-09 |
| 公开（公告）号： | CN103571947A | 公开（公告）日： | 2014-02-12 |
| 发明（设计）人： | 叶伦;李雪梅;付金玲;陈刚 | 申请（专利权）人： | 武汉康录生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102 | 代理人： | 邬丽明 |
| 地址： | 430075 湖北省武汉市*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 用于 检测 kras 基因 热点 突变 试剂盒 及其 方法 | ||
1.一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探针和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列为SEQ.ID NO.1，所述PCR反向引物的序列为SEQ.ID NO.2，所述探针的序列为SEQ.ID NO.3，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQ1；所述PNA的序列为SEQ.ID NO.4；所述测序反应液包含Bigdye、Bigdye缓冲液和测序引物。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由100mmol/LTris-HCl、500mmol/L KCl和15mmol/L MgCl2组成；所述dNTPs的摩尔浓度为2.5mmol/L dNTPs；所述PCR正向引物的摩尔浓度为10μmol/L，所述PCR反向引物的摩尔浓度为10μmol/L；所述探针的摩尔浓度为10μmol/L；所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/μl；所述PNA试剂的摩尔浓度为10μmol/L。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述酶消化液包括核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述核酸外切酶Ⅰ和碱性磷酸酶的酶活力单位比为5：2。
5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述测序反应液含有5×Bigdye、2.5×Bigdye缓冲液和3μmol/L的测序引物。
6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述产物纯化液为0.75M氯化钠溶液。
7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于在所述PCR正向引物的5’端
插入通用M13序列：TGTAAAACGACGGCCAGT，在所述PCR反向引物的5’端插入通用M13序列：CAGGAAACAGCTATGACC，则所述的测序引物序列为：TGTAAAACGACGGCCAGT。
8.一种使用权利要求1～7所述试剂盒检测KRAS基因热点突变的方法，其特征在于它包括如下步骤：
（1）目的基因荧光定量PCR扩增：使用试剂盒中的PCR反应液和PNA试剂，对样品DNA进行PCR扩增反应，得到目的基因的荧光定量结果和PCR产物；
（2）根据步骤（1）中的定量结果，使用试剂盒中的酶消化液，对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后PCR产物；
（3）使用试剂盒中的测序反应液，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行测序PCR反应，得到测序PCR产物；
（4）使用试剂盒中的磁珠和产物纯化液，对步骤（3）得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后测序PCR产物；
（5）将步骤（4）得到的纯化后测序PCR产物加样至测序仪进行序列分析，测序所得基因序列与KRAS基因标准序列进行比对，并查看峰图，判断是否存在KRAS基因热点突变。
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