[发明专利]一种偏甘油酯脂肪酶突变体、质粒、重组菌株及制备方法和应用

权利要求书

1.一种偏甘油酯脂肪酶突变体，其特征在于，该突变体是对马拉色霉菌（Malassezia globosa）偏甘油酯脂肪酶进行定点突变获得的酶突变体，其中突变位点为278位的Phe；所述Phe突变为Arg。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的DNA序列为SEQ NO.2。

3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为SEQ NO.3。

4.一种利用权利要求1～3任意一项突变体制得的质粒。

5.权利要求4所述质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用重叠延伸PCR方法引入目的突变氨基酸位点，先分段扩增含有突变氨基酸位点的上下游基因片段，然后将带有突变位点的基因片段拼接成含有突变位点全长基因片段；

（2）将上述扩增基因PCR产物经DNA纯化后，限制性内切酶Kpn I和Sal I分别对纯化的基因片段和质粒pGAPZαA进行双酶切消化，连接，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞，得到含有偏甘油酯脂肪酶突变体基因质粒。

6.权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR的引物序列如下：

7.一种重组菌株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将权利要求4的质粒经限制性内切酶Bln I线性化后，电转至宿主细胞；

（2）将转化液涂布于含有100mg/ml博莱霉素的YPD平板中，30℃培养3天后，平板上长出酵母单菌落为重组菌株。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为巴斯德毕赤酵母X-33。

9.权利要求7或8所述方法制备的重组菌株。

10.权利要求1或2或3所述偏甘油酯脂肪酶突变体在制备高纯度甘油二酯中的应用。