[发明专利]一种单模块DNA文库及TALENs识别模块的连接方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种TALE连接单元库、包含该TALE连接单元库中所有TALE连接单元的DNA文库、TALENs识别模块的连接方法以及转录激活子样效应因子核酸酶质粒的构建方法。

背景技术

按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入我们需要的序列，一方面可以构建出各种动物模型用于生物学基础研究和疾病机理研究，另一方面可以生产动物反应器用以廉价生产我们需要的又很难从其他途径得到的生物组分。人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交换，其打靶效率非常低，通常只有10^-6～10^-8，这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用，而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。

2009年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的一种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子（transcription activator-like effector，TALE）表现出DNA结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单化的特点，为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。

TALE与Fok1融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）。TALENs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的di-residues（RVDs）位点。

实践中，TALENs技术大大提高了基因打靶效率，应用范围和可操作性，但如何把十几个高度重复的DNA的识别模块组装起来成为了TALENs广泛应用的一个限制因素。研究者们在怎样制作TALENs做出了各种各样的努力。有的采用化学合成的方法，有的采用两步分子克隆的方法，也有的采用一步分子克隆的方法。但都有各自的缺陷，因为需合成的DNA高度重复的序列化学合成非常困难，成本也非常高；两步法因为需两步连接所以材料成本、时间成本、测序成本都较高；现在公开的唯一一个可一步连接的方法最多只能连接14个识别模块，而自然界中常见的识别模块的长度为12-23，在实际应用中很多情况需要大于14个识别模块的TALENs，14个片段长度的限制不止影响此种方法应用，而且不利于TALENs特异性的提高，并且因其需要酶切，纯化，再连接造成操作繁琐，工艺流程复杂，酶切纯化后的DNA保存困难，特别是单链的尾巴容易降解。

以前有研究者用单模块连接TALENs，如连接18个识别模块，一个反应连接18个片段难度非常大，世界范围内还没有人能实现；以前也有建立在双模块基础上的研究，但其只能连接14个识别模块。

发明内容

本发明提供了一种转录激活子样效应因子（TALE）连接单元库，利用该连接单元库可以连接12个以上的识别模块。

技术方案为，TALENs识别模块的连接方法，步骤包括：

（1）根据所需连接的识别模块的顺序，从单元库中选择识别模块所对应的连接单元；所需连接的识别模块数量至少为1；

所述的单元库包括4组×k个连接单元；4组连接单元分别识别4种碱基，任意两组连接单元的粘性末端碱基序列一一对应相同；

所述的连接单元为识别单碱基识别模块及两端经二类限制性内切酶酶切形成的第一粘性末端和第二粘性末端；每组的连接单元包含相同的单碱基识别模块；

同一组的k个连接单元分为两部分，第一部分包含n个连接单元，第二部分包含m个连接单元；其中n≥2，m=0～n-1；

第一部分所有连接单元两端的粘性末端碱基序列互不相同，对第一部分所有连接单元进行顺序编号，第i个连接单元的第二粘性末端与第i+1个连接单元的第一粘性末端互补，1≤i≤n-1；

第二部分连接单元中任意两个连接单元至少一个粘性末端碱基序列不同，且第二部分连接单元中的任意一个连接单元的第一粘性末端与第一部分连接单元中第p个连接单元的第二粘性末端互补，第二粘性末端与第一部分连接单元中第q个连接单元的第一粘性末端互补，其中p≤n-2，3≤q≤n，q-p≥3；