[发明专利]一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用疫苗技术领域，具体涉及一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法。

背景技术

禽呼肠孤病毒是鸡病毒性关节炎和腱鞘炎的主要病原之一，属于呼肠孤病毒科，呼肠孤病毒属的一种。该毒株自1954年首次从患慢性呼吸道病的鸡呼吸道分离得到以来，多种禽呼肠孤病毒分离株相继被报道。随着近年来相关研究的深入，已发现禽呼肠孤病毒可能导致除病毒性关节性和腱鞘炎外的其他病症，在患有呼吸道病、肠道病、心肝病损、蓝翅病、肉鸡矮小综合症、暂时性消化系统紊乱等疾病的鸡体内均分离到禽呼肠孤病毒。

禽呼肠孤病毒在世界范围内均有分布，广泛流行于鸡、火鸡中，其他禽类感染禽呼肠孤病毒的病例也有报道。由禽呼肠孤病毒导致的关节炎、腱鞘炎以及其他病症会造成鸡的废弃率高和生长抑制，饲料转化率低等问题，因此禽呼肠孤病毒的流行往往造成巨大的经济损失，尤其对于养鸡场这种禽类集中的环境，如果禽呼肠孤病毒大规模爆发会形成难以控制的局面。

现有技术中，控制禽呼肠孤病毒发病的主要手段是接种灭活全病毒疫苗，通过免疫接种来控制典型的鸡呼肠孤病毒感染，但目前灭活疫苗多为油包水型，注射时阻力大，不易吸收，并具有一定的毒副作用。因此有必要开发一种剂型更合理，更易吸收同时具有更好的免疫应答效应的疫苗产品。

发明内容

为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

1）病毒的培养、收获：取9-11日龄的SPF鸡胚，制备原代鸡胚成纤维细胞，以2.5×10⁶-3.5×10⁶细胞量/mL的接种量将制备的细胞接种于含有8%(v/v)胎牛血清的M199培养基中，于37℃条件下摇瓶培养过夜；当细胞长满培养基单层时，按细胞悬液0.1-0.3%(v/v)的接种量向细胞悬液中接种毒价≥10^6.5TCID₅₀/0.1mL的禽呼肠孤病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养60-84小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

2）病毒的灭活：将步骤2）得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5-2‰(v/v)，充分摇匀毒液，在摇床上调整摇床转速为180r/min于37℃条件下灭活12-48小时；

3）疫苗的制备：将灭活的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，用磷酸盐缓冲液将灭活的病毒液做1.5-2倍（v/v）稀释，并置于28-32℃水浴锅中进行预热至水浴锅温度，即为水相；取法国赛比克公司的MONTANIDE^TMISA206VG型佐剂，充分混匀后置于28-32℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:0.8-1:1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1h，然后采用ATS工业系统有限公司的AH100D型均质机调整二级阀压力为20-30bar、一级阀压力为400-500bar对该混合物乳化2-3次，即得到一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗。

上述方法中，步骤1）所述的细胞接种量优选为3×10⁶细胞量/mL；步骤1）所述的病毒接种量优选为细胞悬液的0.2%(v/v)；步骤2）所述的甲醛终浓度优选为1‰(v/v)；步骤3）所述的病毒液稀释倍数优选为1.7倍(v/v)；步骤3）所述的水相预热温度优选为31℃；步骤3）所述的油相预热温度优选为31℃；步骤3）所述的水相与油相比例优选为1:1(w/w)；步骤3）所述的均质机参数优选为二级阀压力20bar、一级阀压力450bar；步骤3）所述的乳化次数优选为2次。

本发明的有益效果包括：采用了本土分离的禽呼肠孤病毒，免疫原性好，具有更高的保护率；本发明采用鸡胚成纤维细胞取代利用鸡胚绒毛尿囊膜接种方式繁殖禽呼肠孤病毒，节省了疫苗制备成本，各批间质量差异降低，产量大，病毒毒价和疫苗质量提高；本发明利用均质机对疫苗进行乳化，制备的疫苗为水包油包水型，相对于传统的油包水剂型而言该疫苗粘度低，粒度小，易吸收；本发明选用的佐剂在疫苗制备过程中无需要额外添加任何表面活性剂成分，制备的疫苗安全性好，避免了传统油佐剂难以吸收造成的副作用。

附图说明

图1为疫苗接种后产生抗体水平对比图

具体实施方式

实施例1