[发明专利]一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法

权利要求书

1.一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）病毒的培养、收获：取9-11日龄的SPF鸡胚，制备原代鸡胚成纤维细胞，以2.5×10⁶-3.5×10⁶细胞量/mL的接种量将制备的细胞接种于含有8%(v/v)胎牛血清的M199培养基中，于37℃条件下摇瓶培养过夜；当细胞长满培养基单层时，按细胞悬液0.1-0.3%(v/v)的接种量向细胞悬液中接种毒价≥10^6.5TCID₅₀/0.1mL的禽呼肠孤病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养60-84小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；

2）病毒的灭活：将步骤1）得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5-2‰(v/v)，充分摇匀毒液，在摇床上调整摇床转速为180r/min于37℃条件下灭活12-48小时；

3）疫苗的制备：将灭活的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，用磷酸盐缓冲液将灭活的病毒液做1.5-2倍（v/v）稀释，并置于28-32℃水浴锅中进行预热至水浴锅温度，即为水相；取疫苗佐剂，充分混匀后置于28-32℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:0.8-1:1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1h，然后采用均质机调整二级阀压力为20-30bar、一级阀压力为400-500bar对该混合物乳化2-3次，即得到一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1）所述的细胞接种量为3×10⁶细胞量/mL。

3.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1）所述的病毒接种量为细胞悬液的0.2%(v/v)。

4.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤2）所述的甲醛终浓度为1‰(v/v)。

5.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的病毒液稀释倍数为1.7倍(v/v)。

6.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的水相预热温度为31℃。

7.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的油相预热温度为31℃。

8.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的水相与油相比例为1:1(w/w)。

9.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的均质机参数为二级阀压力为20bar、一级阀压力为450bar。

10.根据权利要求1所述的一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3）所述的乳化次数为2次。