[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测试剂盒包括如下成分：双重荧光定量反应液、酶混合液、RT-PCR 反应液、阳性质控品和无RNA 酶去离子水，其特征在于：所述双重荧光定量反应液中含有草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型特异性引物及双重探针，序列分别为：

草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型：

上游引物：GCRV-Ⅰ-F：5’-CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’；

下游引物：GCRV-Ⅰ-R：5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’ ；

荧光探针：

GCRV-Ⅰ-P：5’-FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3’；

草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型：

上游引物：GCRV-Ⅱ-F：5’-TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’；   

下游引物：GCRV-Ⅱ-R：5’-GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’；

荧光探针：

GCRV-Ⅱ-P：5’-CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’；

草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型的荧光探针报告基团为FAM，草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ1。

2.根据权利要求1所述的一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述双重荧光定量反应液的组成如下：

GCRV-Ⅰ-F（100μM）              5μL

GCRV-Ⅰ-R（100μM）              5μL

GCRV-Ⅰ-P（100μM）              4μL

GCRV-Ⅱ-F（100μM）              6μL

GCRV-Ⅱ-R（100μM）              6μL

GCRV-Ⅱ-P（100μM）              5μL

无RNA酶去离子水                 169μL

Total                            200μL。

3.根据权利要求1所述的一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述酶混合液包括逆转录酶和Taq 酶。

4.根据权利要求1所述的一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为灭活的草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型GCRV09-01株和Ⅱ型GCRV-HZ08株的培养液。

5.一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）提取待测样品中的病毒RNA；

2）以提取的RNA为模板，使用草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型的

上游引物：GCRV-Ⅰ-F：5’-CTCTCTGGCAGAAACACTTAGAC-3’；

下游引物：GCRV-Ⅰ-R：5’-CGTTGTAGAACTCATTTGGGTAGG-3’；

荧光探针：GCRV-Ⅰ-P：5’-FAM-CCGCCATGACCATGCTAACACCTGACA-BHQ1-3’和草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的

上游引物：GCRV-Ⅱ-F：5’-TGATGAGTTCAGTGCCTACG-3’；   

下游引物：GCRV-Ⅱ-R：5’-GAGCCATGAGGTGTGTCTAC-3’；

荧光探针：GCRV-Ⅱ-P：5’-CY5-ATCATAGCAGCCGCCGTCCGTAT-BHQ1-3’ 

进行双重荧光定量PCR检测，其中，草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型的荧光探针报告基团为FAM，草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型的荧光探针报告基团为CY5，淬灭基团为BHQ1；

3）结果分析：反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型、草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型阳性。

6.根据权利要求5所述的一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述双重荧光定量PCR的反应体系包括病毒RNA模板、双重荧光定量反应液、酶混合液、RT-PCR 反应液和无RNA 酶去离子水。

7.根据权利要求5所述的一种草鱼呼肠孤病毒Ⅰ型和Ⅱ型的双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述双重荧光定量PCR的反应条件为42℃ 30min，94～96℃ 3～8min，然后经94～96℃ 7～10s和58～62℃ 32~38s采集荧光信号40个循环。