[发明专利]微拟球藻NgAUREO1基因在调控脂肪酸代谢中的应用

说明书

一、技术领域：

本发明涉及从微拟球藻中克隆了一个新的编码区为1398bp的受蓝光调节的转录因子相关基因(NgAUREO1)，并证明了该基因在调节脂肪酸代谢中的新功能。

二、背景技术：

随着当今世界能源危机的日趋严重，人们已经逐步把目光从传统的石油化工燃料，转向生物质能源上。然而生物体油脂含量的高低是影响生物质能源发展的关键问题之一。已经有许多科学家在这一问题上做了大量的研究。有的通过筛选油脂含量相对较高的生物体作为原料，但仍无法满足生物质能源的需求；有的将生物体置于缺氮、低温等逆境中以促进生物体油脂含量的增高，但是这必然导致生物量的降低；还有人提出通过基因工程对生物体进行改造，使其可以大量积累油脂，然而实验结果多数不尽人意。究其原因主要是所利用的基因多为调控单一通路的功能基因，其调控范围窄，影响能力弱，从而无法达到理想的效果。

转录因子也称反式作用因子，是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其他相关蛋白之间的相互作用可以激活或抑制某些基因的转录。与基因技术定位于改造单个基因不同，转录因子技术影响一系列基因的多条代谢路径，这些代谢路径在同时作用下完成正向或者负向的调控。目前这一技术已经被证实可以促进次生代谢产物在植物细胞中的积累。

Aureochromel于2007年从无隔藻中被发现，研究表明该基因编码的蛋白具有转录因子功能，可以特异性的结合TGACGT序列。这一序列是典型的S型或D型bZIP的结合位点。该基因由一个碱性亮氨酸拉链结构域(bZIP)和一个感受蓝光的LOV结构域组成。正是由于这一特殊的结构赋予了该转录因子受蓝光诱导的特性。研究表明，该基因控制着无隔藻的分支发育活动。然而未有研究证明该基因具有其他功能。

我们从微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)中克隆了一个新的蓝光诱导的bZIP类转录因子，并命名为NgAUREO1。该基因所编码的蛋白具有一个bZIP结构域用于结合目的基因启动子区的特异性序列，以及一个可以感受波长为470nm的蓝光的LOV结构域。该基因与无隔藻中aureochromel的氨基酸序列相似性为59％。我们构建了该基因的酵母表达载体并将此转录因子导入酿酒酵母中，通过测定酵母脂肪酸的含量，证明了该转录因子可以促进酵母细胞内油脂含量的增加。我们还通过对转有该基因的酿酒酵母进行蓝光照射，并测定脂肪酸含量，证明了蓝光可以控制该转录因子参与脂肪酸的合成与分解。

三、发明内容：

1、克隆了微拟球藻中的蓝光诱导转录因子NgAUREO1

从本实验室所建立的微拟球藻转录组数据库中找到aureochromel基因的片段，根据该片段设计了两对基因特异性引物(5GSP1，5GSP2和3GSP1，3GSP2)。利用TransZol Plant total RNA提取试剂盒提取微拟球藻RNA，用TransScript RT反转录试剂盒反转录形成cDNA，通过PCR扩增得到NgAUREO1基因的全长，连接到pMD19-T载体上，导入感受态大肠杆菌，挑选阳性克隆菌株进行菌液PCR鉴定。最后将带有目的基因片段的大肠杆菌送上海生工测序。测序结果表明该基因的ORF为1398bp；5’端非编码区为192bp；3’端非编码区为490bp，编码465个氨基酸。将测序结果与无隔藻中aureochromel基因的序列进行相似性比较，发现微拟球藻中的aureochromel基因编码的氨基酸序列与无隔藻中相应基因编码的氨基酸序列有59％的同源性。将这个蛋白序列进行BLAST分析，显示该蛋白的241-300位氨基酸为一个bZIP转录因子结构域；341-444位氨基酸为一个可以感受蓝光的LOV结构域。以上分析说明该基因为微拟球藻中的一类新的可以感受蓝光的bZIP类转录因子，命名为NgAUREO1。

2、构建了NgA UREO1基因的酵母表达载体pYES2-NgAUREO1

设计一对带有HindIII和SacI限制性酶切位点的引物(P1，P2)以微拟球藻cDNA为模板扩增NgAUREO1基因，并将扩增产物纯化后连接到pMD19-T载体上，导入大肠杆菌中进行繁殖。提取质粒利用HindlII和SacI限制性酶对pMD19-T和pYES2同时进行双酶切，分别获取小片段和大片段，利用T4连接酶进行连接后转化大肠杆菌并进行PCR和酶切鉴定后得到重组质粒pYES2-NgAUREOl。

3、证明了该基因可以促进脂肪酸积累的新功能