[发明专利]一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法和应用

权利要求书

1.一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，将35S强启动子和油桐油酸脱氢酶基因vfFAD2构建表达载体导入粘红酵母，使vfFAD2基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下：

（1）粘红酵母进行活化和扩培；

（2）采用同源序列克隆法，以油桐基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶回收试剂盒回收纯化，进行TA克隆并测序，获得目的基因vfFAD2；

（3）目的基因vfFAD2与表达载体pBI121重组，获得重组载体pBI121-vfFAD2，酶切、测序验证重组载体；

（4）利用农杆菌介导法，重组载体pBI121-vfFAD2转化粘红酵母，将微孔滤膜转移到含60 μg·mL-1链霉素，200 μg·mL-1头孢霉素和100 μg·mL-1卡那霉素的SMⅠ筛选培养基中，培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 μg·mL-1头孢霉素，150 μg·mL-1卡那霉素的SMⅡ平板上划线，培养3-5 d后，能正常生长的初步认定为阳性转化子，提取基因组DNA，PCR验证获得阳性转化子；

（5）气相色谱法检测，转基因粘红酵母转化子中亚油酸含量和粘红酵母野生型相比，亚油酸相对含量则分别从6.65%提高到13.49%，提高了102.86%。

2.根据权利要求1所述的一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）中扩增引物为：

FAD2-F：5’-TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3’；

FAD2-R：5’-GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3’；

PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；3. PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

3.根据权利要求1所述的一种粘红酵母高产亚油酸基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤（4）60 μg·mL-1链霉素，200 μg·mL-1头孢霉素和100 μg·mL-1卡那霉素的SMⅠ筛选培养基中培养3-5 d后，将初筛得到的转化子与野生型粘红酵母同时在含300 μg·mL-1头孢霉素，150 μg·mL-1卡那霉素的SMⅡ平板上划线筛选初步获得阳性转化子，提取基因组DNA，进行PCR验证进一步鉴定阳性转化子。

4.一种粘红酵母的培养方法，其特征在于，将粘红酵母保藏斜面转接到PDA培养基上，28℃培养48h 之后，挑2 环接入装有50mL 液体种子培养基的250mL 三角瓶中，28℃振荡培养24h，然后按1:10 的接种量接入装有50mL 发酵培养基的250mL 三角瓶中，于28℃振荡发酵72 h，发酵结束经离心收集菌体；

种子培养基：15 g·L^-1葡萄糖，1 g·L^-1酵母粉，2 g·L^-1(NH₄)₂SO₄，7 g·L^-1 KH₂PO₄，2 g·L^-1Na₂HPO₄，1.5 g·L^-1 MgSO₄，PH 5.5；发酵培养基：50 g·L^-1葡萄糖，1 g·L^-1酵母粉，2.5 g·L^-1 (NH₄)₂SO₄，7 g·L^-1 KH₂PO₄，2 g·L^-1 Na₂HPO₄，2 g·L^-1 MgSO₄，0.1 g·L^-1CaCl₂，0.07 g·L^-1FeCl₃，PH 5.5。

5.一种如权利要求1 所述的粘红酵母高产亚油酸基因工程菌（Rhodotorula glutinis）在生产微生物油脂方面的应用。