[发明专利]一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于抗病毒治疗技术领域，涉及一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体及其制备方法。

背景技术

慢性病毒如HBV、HIV、HCV等感染严重危害人类健康，已成为国家重点防治的疾病，病毒感染的治疗难题迫在眉睫。病毒寄生在宿主细胞内以复制的方式进行增殖。无论是体液免疫还是细胞免疫，免疫作用机制是在细胞外液和细胞膜表面完成的。通过增强病毒外膜抗原的免疫原性和突破宿主的免疫耐受来治疗和预防此类疾病的效果非常有限。如何设计细胞内阻断病毒组装和复制的抗病毒免疫学方法成为亟待解决的问题。

既往抗病毒感染的研究取得很大进展，但仍不理想。抗病毒药物如细胞因子（干扰素和胸腺肽等），缺乏特异性，半衰期短，有效率仅为10%～30%；核（苷）酸类似物、病毒复制酶的抑制剂、鸡尾酒疗法大都对活跃复制的病毒有抑制作用，却不能清除潜伏状态或非复制期的病毒，长期使用毒副作用大，易耐药、易复发。治疗性疫苗如蛋白质疫苗和DNA疫苗治疗机制未完全明确、高效诱导免疫反应的疫苗难以设计，佐剂的选择、抗病毒药物联合使用，疫苗安全性问题，以及过量诱导免疫应答造成的危害仍在试探与研究。

生物治疗的新理论、新方法如依赖核酸的基因治疗：RNAi技术、核酶、siRNA、microRNA、核酸适配子、肽核酸技术等，在体外细胞内的研究显示能够有效地抑制病毒的复制，但寡聚核酸合成困难、易被降解、导入困难、非特异性等缺点却难以克服。依赖蛋白质的基因治疗，如胞内抗体、肽类适配子技术、抗病毒蛋白的转基因治疗等是在病毒蛋白的翻译水平抑制病毒的复制。但该技术遇到的挑战是如何筛选和长期稳定表达针对病毒复制和转化蛋白具有中和作用的细胞内抗体，并在细胞内还原条件下形成正确的结构。

基因治疗的载体作为外来抗原可激活机体的免疫应答使载体失活，载体导入也可能会对人体造成严重的后果，细胞内真核表达抗体，会形成永久的基因改变。因此在整体水平采用基因治疗的安全性评估成为最棘手的问题。因此，免疫治疗应该成为清除病毒最主要的机制。既往清除病毒的免疫机制是针对病毒的外衣壳蛋白质抗原，刺激机体产生中和性抗体和细胞毒性T细胞的结果。但HCV和HIV等由于病毒外衣壳蛋白质的免疫原性低和免疫表位的结构域多变异等原因，难以制备具有中和作用的抗体发挥免疫预防和免疫治疗的作用。目前依然不能成功建立清除病毒的免疫学治疗方法。

此类病毒的核心蛋白在病毒的生活周期中发挥着重要的作用，是病毒复制和包装的不可获缺的重要组成部分，也是病毒细胞免疫的重要调控元件，并且核心蛋白具有变异性小，免疫原性强的特点，病毒感染后能够持久产生高效价抗体。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体及其制备方法，该方法适于不同的慢性病毒感染的治疗，比如HIV、HCV、HCMV、HPV、EB、HSV等等。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体，其特征在于，包括相偶联的针对病毒核心蛋白的抗体和蛋白转导域，两者偶联后构成穿膜抗体。

所述的针对病毒核心蛋白的抗体为单克隆抗体，所述的蛋白转导域为TAT、ant、HSV VP22、PDX1、Pep-1或Transportan10的穿膜肽；

所述的针对病毒核心蛋白的抗体与蛋白转导域通过EDC偶联。

所述的针对病毒核心蛋白的抗体为针对HIV、HCV、HCMV、HPV、EB或HSV病毒的抗体，所述的蛋白转导域为SEQ.ID.NO.1所示的穿膜肽。

所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体抑制细胞病毒复制，并抑制细胞内、外病毒的表达。

所述的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体为HBcMAb-TAT PTD，能够抑制细胞内、外HBsAg、HBeAg及细胞内HBcAg的表达，且存在剂量依赖关系。

一种靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体的构建方法，包括以下步骤：

分别将针对病毒核心蛋白的抗体、蛋白转导域溶解后，加入到EDC溶液中，室温下充分反应；

反应完成后加入饱和硫酸铵进行沉淀，4℃放置过夜，离心去上清，PBS缓冲液溶解沉淀；将溶解产物放置于透析袋中，加入PBS缓冲液透析，3～4h更换一次透析液；更换3～4次，直至透析完全；将透析的产物全部收回，得到靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体。

所述的针对病毒核心蛋白的抗体为HBcMAb，蛋白转导域为TAT。

所制备的靶向病毒核心蛋白的穿膜抗体的转染方法，包括以下操作：