[发明专利]基于组织因子的肿瘤核酸疫苗、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸疫苗、制备方法及其应用，尤其是一种肿瘤核酸疫苗、制备方法及其应用。

背景技术

组织因子(tissue factor, TF) 的凝血功能众所周知，它与活化凝血因子Ⅶ(activated factor Ⅶ, F Ⅶa) 结合后，形成TFPF Ⅶa复合物，启动外源性凝血途径；亦可激活凝血因子Ⅺ，启动内源性凝血系统。它是机体内活性最强的促凝物质之一，在生理性止、凝血过程及多种血栓栓塞性疾病中发挥重要作用。然而，TF作为凝血系统中惟一在细胞表面表达的跨膜糖蛋白，是否具有受体特性并具备非凝血功能，逐渐成为众多学者关注的焦点。近期研究提示，TF具有信号传导受体的功能，可通过介导多种信号传导，影响肿瘤侵袭与转移、胚胎发育、血管新生、炎症、动脉粥样斑块形成等多种病理、生理过程。

以组织因子作为靶点来治疗肿瘤是现在肿瘤研究中的一个热点。最直接的优点就是靶向性好。正常的生理条件下，TF一般不外露，只有在肿瘤血管内皮和肿瘤细胞中才特异性表达升高。这就为肿瘤的靶向免疫治疗提供了可能。但是如果用TF全蛋白免疫，就很可能带来全身性的凝血功能障碍。

国外学者以组织因子为靶点，进行免疫治疗，最有成就的进展是HU和Garen将免疫球蛋白G1（IgG1）的Fab段换作凝血因子VII（FVII），即TF的天然配基，同时突变FVII的341密码子：从赖氨酸AAG突变为丙氨酸GCC，使二者结合以后的促凝活性部分丧失。结果发现具有良好的抗肿瘤作用。但是，他们以TF全蛋白作为靶点，用抗体或FVII进行治疗，存在着蛋白质结构复杂、工艺难度大、易引发机体过敏反应等缺点。

核酸疫苗是指将含有编码抗原蛋白目的基因的质粒载体直接注入体内，通过宿主细胞的转译系统表达目的抗原，并诱导机体产生免疫应答的一类新型疫苗。由于其在体内选择性表达目的产物，并将其以自然加工形式递呈给免疫识别系统，故兼具重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导机体产生体液免疫和细胞免疫的双重性，与传统的疫苗相比具有免疫原性好、效果持久等特点。另外核酸疫苗可在工程菌中快速复制，制备提纯方法简便，大大降低了成本，已显示出巨大开发潜力和应用前景。

核酸疫苗DNA骨架中除包含有编码抗原基因的区域，在其质粒载体非编码区中还含有由未甲基化的胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)基元组成的免疫刺激序列(immunostimulatory sequences，ISS)。该ISS序列可作用于多种免疫活性细胞，增强非特异性免疫反应，激发淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞扩增、成熟和分泌多种细胞因子、趋化因子以及免疫球蛋白。由于具有免疫刺激作用，ISS序列作为在位疫苗佐剂可极大增强核酸疫苗被细胞摄取后针对目的抗原产生的体液免疫和细胞免疫，在核酸疫苗的开发中具有极大的应用前景。总之，核酸疫苗除可用于预防和治疗传染性疾病以外，为治疗自身免疫性疾病及肿瘤提供了新思路。

发明内容

本发明的目的是提供一种以组织因子为靶抗原表位的肿瘤核酸疫苗。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种基于组织因子的肿瘤核酸疫苗，以质粒为载体，质粒中插入编码乙肝核心抗原（HBc）的DNA序列，并在该序列中插入编码人源TF靶标表位多肽的DNA序列，人源TF靶标表位多肽序列见SEQ ID NO：1，该多肽为人源TF的74-94位氨基酸；所述质粒载体的非编码区中含有ISS序列。

进一步的，所述编码人源TF靶标表位多肽DNA序列插入HBc的第80-81位氨基酸所对应的核苷酸序列中。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗的制备方法，其步骤包括：分别合成编码人源TF靶标表位多肽序列、HBc序列和ISS序列的DNA，将这些DNA分步插入真核表达载体，构建重组质粒；转化大肠杆菌工程菌；经碱裂解法对发酵后工程菌中的质粒DNA进行粗提；粗提液经纯化，并用乙醇沉淀收集。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗在制备预防和治疗黑色素瘤药物中的应用。

本发明还提供了上述的基于组织因子的肿瘤核酸疫苗在制备预防和治疗乳腺癌、前列腺癌、胃癌、胰腺癌或肺癌药物中的应用。