[发明专利]一种食源性病原微生物核酸侧向流试纸条检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及食品及加工原料中沙门氏菌的核酸扩增产物侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。 

背景技术

为有效控制食品生产和进出口贸易中因致病性微生物引起的食源性疾病，保证食品领域的公共安全，需要开发灵敏、便捷、准确的食源性病原微生物检测方法。在食源性疾病危险因素中，在我国流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒位居第一，而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是沙门氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球、单增李斯特菌、大肠杆菌0157: H7等病原菌。沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，寄生于人类和动物肠道内，可以按照生化反应的不同分为4个亚属，即生化反应典型的和最常见的沙门氏菌亚属I、生化反应不典型的亚属II和Ⅳ，亚属III是亚利桑那沙门氏菌。沙门氏菌具有复杂的抗原结构，包括菌体抗原(O)、鞭毛抗原(H)和表面抗原（荚膜或包膜抗原）。有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。 

在传统的食品生产、质量监督和进出口检验检疫中常规的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期长，同时对于有些细菌仍无法给出快速和准确的鉴定，不能完全满足农产品及进出口检验检疫的检测要求。基于核酸扩增的方法检测对象是来自病原微生物的DNA，经特异性扩增后进行产物鉴定，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速，主要的方法包括普通／荧光PCR方法、以及环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)、分支滚环扩增(hyper-branched rolling cycle amplification，HRCA)及链替代扩增(SDA)等恒温扩增一检测技术。 

荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR技术使定性检测迈上了可以量化的台阶，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前己广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。但是，实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测，常规的PCR扩增检测需要对PCR产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度。 

发明专利“一种检测牛乳中沙门氏菌的方法”（公开号：CN101149355A）及“沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒”(公开号：CN101153327)均提供了以恒温扩增结合凝胶电泳或原位杂交进行检测的方法，该类方法不需循环变温PCR，可以明显提高检测的灵敏度，但检测手段并无明显改良，操作仍嫌复杂。 

另一类检测方法是基于双抗体夹心的免疫学检测方法，其检测对象主要是蛋白质分子，竞争法检测的对象为小分子化合物和半抗原分子，这两种免疫学检测方法都可以用免疫胶体金试纸条的方法实现，是快速检测的常规方法，具有快速、简单、成本低廉的优点，广泛用于食品中毒素、病原微生物以及农药、抗生素残留的筛查。过去病原微生物的免疫学检测主要依据上述抗原与抗体的结合反应，用酶联免疫吸附(ELISA)方法或免疫胶体金胶体金试纸条或完成检测。在免疫胶体金检测中，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原一抗体一有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成肉眼可见的有色沉淀线，对蛋白的检测 

依赖高亲和力和高特异性抗体的获得，在病原物分析时因为基因编码的规律和简并规则，DNA较蛋白质更易于产生序列差异，这种差异也更易于准确检出，通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率，通过在PCR扩增引物中引入特殊的标记物就可以实现双链产物的免疫学检测。