[发明专利]TALEN在制备靶向干预乙肝病毒的药物中的应用

说明书

技术领域

本发明属医药领域，涉及TALEN技术在靶向乙肝病毒基因组及治疗慢性乙肝病毒感染中的应用。

背景技术

乙肝病毒（HBV）是一种肝嗜性小DNA病毒，其引起的慢性肝炎、肝纤维化和肝癌严重危害着人类的健康。全球约3.5亿人慢性感染有乙肝，其中亚洲占约3/4。

乙肝病毒病毒核衣壳内的乙肝病毒基因组是含有不完全双链的DNA（rcDNA），在病毒感染人肝细胞后，随着核衣壳脱去，rcDNA会入核并经由修补机制形成共价闭合环状的DNA（cccDNA）。cccDNA可经由宿主RNA聚合酶II转录出包括乙肝病毒病毒前基因组RNA（pgRNA）在内的多条长短不一的乙肝病毒RNA，病毒蛋白即以此些RNA作为模板进行翻译，其中pgRNA还可以作为模板通过逆转录生成rcDNA，进而包装入病毒核衣壳蛋白而进入新的一轮复制周期。此外，研究表明cccDNA可以结合宿主组蛋白以形成微小染色体结构，该结构非常稳定以致cccDNA的最终消失可能要伴随其所在肝细胞的死亡。正是由于cccDNA在乙肝病毒复制过程中作为DNA-RNA-DNA模板以及cccDNA很难彻底于肝内清除的特性，cccDNA在乙肝病毒感染慢性化、再发及治疗停止耐药中扮演重要角色。

当前用于治疗慢性乙肝病毒感染的药物有干扰素α（IFN-α）或阻断病毒RNA或DNA合成的核苷类似物，但是IFN-α治疗应答率仅30%而核苷类似物的长期使用易导致乙肝病毒耐药，同时这两种药物但都不直接靶向cccDNA，这也是目前的治疗手段应用于许多慢性乙肝病毒感染患者中效果不佳且易引起复发的原因之一。发明一种特异性靶向cccDNA的治疗方法对于乙肝病毒治疗乃至根治乙肝病毒慢性感染有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供转录激活因子样效应因子（Transcriptionactivator-likeeffectors，TALE）核酸酶在制备靶向干预乙肝病毒的药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种针对乙肝病毒的转录激活因子样效应因子核酸酶。

本发明的再一个目的是提供一种利用转录激活因子样效应因子核酸酶抑制体外培养细胞中乙肝病毒的方法。

为了解决上述技术问题，本发明首先设计了两对针对乙肝病毒基因组的特异性TALEN，在设计过程除考虑TALEN识别长度（12-19bp）及左右臂间隔长度（14-19bp）外还额外考虑了以下两点以保证TALEN对乙肝病毒的有效性：

1、根据NCBI公布的已有乙肝病毒A型、B型、C型序列（其中我国主要是B型和C型），下载并比对了各型别代表株的序列，确定了各型别乙肝病毒基因组的保守序列区段，进而针对这些区段设计TALEN，以利于设计出的TALEN可以广谱靶向各型别的乙肝病毒。

2、设计TLANE时避开了根据文献报道可能结合有宿主组蛋白的cccDNA区段，以利于TALEN结合至cccDNA。

本发明最终设计并构建完成的TALEN分别针对在cccDNA序列中转录pgRNA相关的片段的头尾，其中头部设计在与Core、Pol、HBeAg和pgRNA转录密切相关的区段；尾部设计在HBx启动子区域，其亦为乙肝病毒其他各条病毒RNA转录所共有的区域。

利用细胞和小鼠模型,经过无数次试验摸索以及反复优化条件，本发明最终获得了一种TALEN,其不仅可以抑制乙肝病毒抗原标志物HBsAg和HBeAg的产生，并且可以部分降低cccDNA的含量及可以使cccDNA特定位点发生突变进而导致转录失活；此外，在合适时间加入IFN-α（α干扰素）等乙肝治疗药物可以进一步降低pgRNA转录水平和cccDNA的含量，显示联用TALEN和其他抗病毒及免疫调节药物在治疗乃至根治乙肝病毒感染中的可能性。

本发明提供了一种转录激活因子样效应因子核酸酶在制备抑制乙肝病毒药物中的应用。

所述的抑制乙肝病毒药物的活性成分是针对乙肝病毒的转录激活因子样效应因子核酸酶。

本发明提供了一种抑制体外培养细胞中乙肝病毒的方法，将针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶转入含有乙肝病毒的体外培养细胞。

所述的体外培养细胞源自肝细胞。

所述的体外培养细胞是肝癌细胞。

所述的抑制体外培养细胞中乙肝病毒是指抑制乙肝病毒的病毒蛋白转录和cccDNA活性。

本发明提供的种抑制体外培养细胞中乙肝病毒的方法，包括如下步骤：

（1）设计并预处理针对乙肝病毒基因组的转录激活因子样效应因子核酸酶；