[发明专利]一种来源于土壤宏基因组文库的壳聚糖酶基因及其获取方法与用途

权利要求书

1.一种来源于土壤宏基因组文库的壳聚糖酶基因，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的壳聚糖酶基因的DNA序列的获取方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）土壤宏基因组文库的构建：提取土壤中微生物宏基因组DNA，用Fosmid载体构建插入片段为35-50kb的土壤宏基因组文库；将所获得的文库转染细菌后，涂布在含有壳聚糖的LB固体培养基上培养；

（2）亚克隆文库的筛选：挑取菌落周围有透明圈的菌株，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切质粒后，割胶回收2-6kb DNA片段；将回收的DNA片段与相同限制性内切酶酶切的pUC19连接并导入E.coli DH5α，涂布在含有壳聚糖的LB固体培养基上培养；挑选菌落周围有透明圈的菌株，提取重组质粒并测序；

（3）壳聚糖酶基因的DNA序列的获取：根据测序结果设计带有酶切位点的引物PCR扩增出剪切信号肽的壳聚糖酶基因chiA；琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pMD-19T simple vector连接得到pMD-19T simple vector-chiA，转化E.coli JM109，经酶切鉴定并测序。

3.一种壳聚糖酶，由SEQ ID NO：1所述的壳聚糖酶基因编码得到。

4.根据权利要求3所述的一种壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种重组质粒，包括DNA序列为SEQ ID NO：1所示的壳聚糖酶基因。

6.一种获得大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）含编码壳聚糖酶基因的表达质粒的构建：将权利要求2制得的pMD-19T simple vector-chiA与pET-28a质粒均用BamHI和HindIII进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET28a-chiA，并对重组质粒进行序列测定；

（2）大肠杆菌工程菌E.coli Rosetta-gami/chiA的构建：将重组质粒pET28a-chiA转化到E.coli Rosetta-gami中，IPTG诱导6-10h，即得。