[发明专利]罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及水生动物病毒检测领域，特别涉及一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

罗氏沼虾白体病(white tail disease, WTD)，又称白尾病，是由罗氏沼虾野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus, MrNV）引起的一种主要危害罗氏沼虾淡化苗，以病虾肌肉出现白斑、白浊或全身发白为特征的传染病，死亡率最高达100%，对罗氏沼虾养殖业造成极大的危害。目前，WTD是世界性的罗氏沼虾疾病，该病已被列为OIE申报疫病和我国水生动物二类疫病。

研究表明，罗氏沼虾野田村病毒颗粒为均匀对称的20面体结构，表面光滑，无囊膜，直径为26-27nm,由两个RNA片段组成，其序列已测定并在GeneBank上登录（登录号分别为AY222839，AY222840）。目前该病毒的检测方法有电镜法、RT-PCR检测法、TAS-ELISA检测法等，但在实际检测工作中，现有的检测技术存在以下问题：一是灵敏度不够，无法检测到潜伏感毒样品；二是容易产生假阳性，对模板质量要求高；三是操作繁琐，对实验条件要求高，不利于养殖户和一线生产技术人员来操作。

RT-LAMP是一种新型的核酸等温扩增检测技术，即依据环介导等温核酸扩增技术（LAMP）的原理，针对靶基因的特定区域设计4条特异性引物，利用一种具有链置换特性的DNA聚合酶和AMV逆转录酶的同时作用下，使RT和LAMP反应在同管中同时进行，简化了操作步骤，在等温条件下就可以高效、高特异地扩增靶序列。LAMP产物的检测一般采用琼脂糖凝胶电泳、浊度观察、荧光染料观察等方法。

侧向流层析试纸（lateral flow dipstick, LFD）是一种检测产物的新方法，利用反应体系中的FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，减少了电泳环节、染料颜色的人为目测差异以及由非特异性扩增造成的假阳性问题。LFD检测相对于其他检测手段，有操作简便且安全的特点。LAMP-LFD反应结果可以直接肉眼观察。LFD试纸上有质控带和检测带，两条带都显色表示阳性，只有质控带而检测带不显色表明检测结果为阴性。该方法具有安全、快捷、高效、高灵敏度且无高的实验条件要求，适合应用推广。目前，该技术在罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）的检测中未见报道。

发明内容

本发明的目的在于是提供一种应用环介导恒温扩增技术结合色谱侧向层析试纸来检测罗氏沼虾野田村病毒的方法，特异性强，敏感率高。

本发明另一目的在于提供一种用于上述方法的检测试剂盒，该试剂盒特异性强，敏感率高，而且操作简便快捷，克服现有检测方法不能在生产中直接应用的问题，适合罗氏沼虾白体病的筛查与预防。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法，包括如下步骤：

病毒RNA的提取：

（1）取20-30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350-500μL裂解液匀浆，离心；

（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；

（4）用RNase free water（无核糖核酸酶水）洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA；

RT- LAMP扩增反应：

（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16-21μL，包括：1.4-2.0mmol/L 引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl，10-20mmol/L 氯化钾，10-20 mmol/L 硫酸铵，5-10mmol/L 硫酸镁，0.1-0.3% Triton X-100，0.4-0.8mol/L 甜菜碱，1.4-1.6mmol/L dNTP，1-2U逆转录酶AMV，6-10U Bst DNA 聚合酶大片段；