[发明专利]罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

病毒RNA的提取：

（1）取20-30mg罗氏沼虾幼虾或成虾肌肉组织，加入350-500μL裂解液匀浆，离心；

（2）取步骤（1）离心所得上清液，与等体积的70%无水乙醇混合均匀后，将混合液与玻璃纤维素膜结合；

（3）依次用去蛋白液和漂洗液洗涤玻璃纤维素膜；

（4）用RNase free water洗脱玻璃纤维素膜上吸附的RNA；

RT- LAMP扩增反应：

（5）配制预反应液，所述预反应液体积为16-21μL，包括：1.4-2.0mmol/L 引物MrNV-FIP，1.4-2.0mmol/L引物MrNV-BIP，0.2mmol/L 引物MrNV-F3，0.2mmol/L引物MrNV-B3，0.05-0.15μmol/L 探针MrNV-FITC-PROBE，10-30mmol/L pH8.0-9.0的Tris-HCl，10-20mmol/L 氯化钾，10-20 mmol/L 硫酸铵，5-10mmol/L 硫酸镁，0.1-0.3% Triton X-100，0.4-0.8mol/L 甜菜碱，1.4-1.6mmol/L dNTP，1-2U逆转录酶AMV，6-10U Bst DNA 聚合酶大片段；

引物MrNV-FIP序列见SEQ ID NO：1，引物MrNV-BIP序列见SEQ ID NO：2，引物MrNV-F3序列见SEQ ID NO：3，引物MrNV-B3序列见SEQ ID NO：4，探针MrNV-FITC-PROBE序列见SEQ ID NO：5；

（6）在16-21μL预反应液中加入4-9μL步骤（4）所得 RNA作为模板，控制反应体系总体积为20-25μL，然后在60℃-65℃下反应15-60min；

LFD试纸检测：

（7）取步骤（6）所得RT- LAMP扩增反应产物5-10μL滴到LFD试纸的点样处，然后在点样处前端滴上50-100μL缓冲液，5-15分钟后根据试纸条上的显色带判定检测结果。

2.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于：所述裂解液包括浓度为30-60mmol/L 的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为3-6mol/L的异硫氰酸胍，以及浓度为5-10mmol/L EDTA。

3.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于：所述去蛋白液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，浓度为0.4-0.6mol/L异硫氰酸胍，以及体积浓度为10-30%的无水乙醇。

4.根据权利要求1所述的罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于：所述漂洗液包括浓度为10-50mmol/L的pH7.3-7.6 Tris-HCL，50-150mmol/L NaCl，以及体积浓度75%的无水乙醇。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的罗氏沼虾野田村病毒RT-LAMP-LFD检测方法，其特征在于：引物MrNV-FIP为5’端生物素标记引物；探针MrNV-FTIC-PROBE为5’端FITC标记探针。