[发明专利]热休克蛋白70作为免疫佐剂的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种热休克蛋白70作为免疫佐剂的应用。

背景技术

热休克蛋白70(Heat shock protein70,Hsp70)，是一类分子量约70kD的热休克蛋白，也是目前发现的主要分子伴侣蛋白之一。Hsp70对调节蛋白内环境的稳定具有重要作用，可维持细胞蛋白自稳，提高细胞对应激原的耐受性，使细胞维持正常的生理功能。研究表明，Hsp70不仅参与细胞正常的生长、发育和分化，而且与细胞和机体的免疫有关。病原体和宿主细胞产生的Hsp70大多有共同的抗原决定簇，从而可以增强宿主细胞的体液和细胞免疫反应。另外，作为一种分子伴侣，Hsp70还可以通过与抗原的相互作用，从而促进抗原向MHCI分子的转运。

发明内容

本发明目的在于提供一种热休克蛋白70作为免疫佐剂的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种热休克蛋白70作为免疫佐剂的应用。

进一步的说，所述大菱鲆热休克蛋白70作为免疫佐剂的应用。

将所述热休克蛋白70表达的质粒与DNA疫苗质粒分别在PBS中稀释至400ug/ml，稀释后按1:1比例混合，待用。

所述热休克蛋白70表达的质粒是以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物与载体pEASY-E2连接，获得质粒pEASY-Hsp70；用限制性内切酶EcoRV酶切pEASY-Hsp70后回收2kb片段，与质粒pCN3连接，得质粒pSmHsp70。

本发明具有如下优点：Hsp70可作为增强肽或多糖免疫佐剂，本发明的热休克蛋白70能够显著提高DNA疫苗的免疫保护效应。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。

在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.大肠杆菌用Hanahan方法（Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001）。

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。

实施例1

热休克蛋白70表达质粒pSmHsp70的构建：

本发明的热休克蛋白70的序列已公开（GenBank accession No.ABP04033.1）。以大菱鲆cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增。PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA,然后94℃40s,58℃60s,72℃60s,5个循环后改为94℃40s,65℃60s,72℃60s,30个循环后再在72℃延伸反应7－10min。PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。PCR产物用T4DNA连接酶与载体pEASY-E2(购于TransGen Biotech,北京)在室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素（100ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，即为质粒pEASY-Hsp70。用限制性内切酶EcoRV酶切pEASY-Hsp70后回收2kb片段；将质粒pCN3（构建过程参见Jiao XD,Zhang M,Hu YH,Sun L.Construction and evaluation of DNA vaccines encoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine2009;27:5195–202.）用EcoRV酶切,回收5.4kb片段。将上述两片段用T4DNA在室温连接2－4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素（50ug/ml）的LB培养基上培养18－24小时,筛选转化子提取质粒，命名为pSmHsp70。通过DNA测序分析证明了pSmHsp70为含有热休克蛋白70序列的表达质粒。

所述LB组成成分按重量百分比计：1.0%蛋白胨,0.5%酵母粉,1.0%氯化钠,97.5％蒸馏水。所述F1为5’-GATATCGCCACCATGTCTAAGGGACCAGCTG-3’；R1为5’-GCGCGATATCGTCCACCTCCTCAATGGT-3’。

实施例2