[发明专利]一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法

权利要求书

1.一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

  （1）湿菌体的制备

   将嗜酸乳杆菌置于三角瓶中，于60-70℃水浴35-45min 加热杀死菌体，然后加入0.5%Triton X-100溶液，于80-90℃水浴0.5-1.5h，并不断连续搅拌，取出溶液置冰浴中立即冷却，于10000×g-15000×g离心8-12 min后弃上清，将沉淀再用双蒸水充分洗涤两次，再次于10000×g-15000×g离心8-12 min后弃上清，然后用甲醇-水、甲醇依次洗涤去除沉淀中的杂质后得到湿菌体；

  （2）酶解破壁

将湿菌体加入酶溶液Ⅰ中，于35-40℃水浴10-14 h，再于4℃、10000×g-15000×g离心30-50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅱ中，于35-40℃水浴10-14 h，再于4℃、10000×g-15000×g离心30-50min弃上清，取沉淀加入酶溶液Ⅲ中，于35-40℃水浴处理20min，再于4℃，10000×g-15000×g离心30-50min弃上清取沉淀；

  （3）去脂去蛋白

   将步骤（2）所得沉淀依次经甲醇、甲醇-氯仿及氯仿洗涤脱脂，于10000×g-15000×g离心35-45min后弃上清，取脱脂后的沉淀加入一定量的酶溶液Ⅳ中，于35-40℃消化10-15h，再于4℃，10000×g-15000×g离心30-50min，取沉淀加入酶溶液Ⅳ进行消化离心重复3次弃上清，得到去脂去蛋白沉淀；

  （4）纯化

将步骤（3）得到的去脂去蛋白沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5-3.5d后，经0.01 mol/L的硫酸溶液于85-95℃ 处理5min后，冰水浴中立即冷却，再于4℃ 、10000×g-15000×g离心25-35min弃上清, 取沉淀用去离子水在4℃条件下连续透析2.5-3.5d，冷冻干燥得到嗜酸乳杆菌肽聚糖；其中硫酸溶液与原料嗜酸乳杆菌的比例为2mL：3g；

  （5）TEMPO-NaClO-NaBr选择性氧化修饰

   在烧杯中加入一定量的嗜酸乳杆菌肽聚糖和适量的蒸馏水，再加入一定量的四甲基哌啶（TEMPO）和NaBr，用玻璃棒搅拌均匀，制得肽聚糖乳液，在肽聚糖乳液中加入一定量的NaClO，控制温度为4℃，调节pH为8.4-8.6，反应25-35min，加入Na₂SO₃还原未反应的微量氧化剂，加入少量乙醇终止反应，将反应液倒于过量的乙醇中，并不断搅拌，静置一段时间，抽滤得到滤饼，将滤饼用乙醇水溶液多次反复洗涤后，透析，冷冻干燥，得到氧化修饰的嗜酸乳杆菌肽聚糖产物。

2.根据权利要求1所述的一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于：所述的酶溶液Ⅰ配制方法如下：氯化镁0.1017 g ，胰蛋白酶50 mg ，DNase 5 mg，RNase 7.5mg，溶解于50mL pH7.2 的Tris-HCl溶液中；所述的酶溶液Ⅱ配制方法如下：α-糜蛋白酶25mg ，胰蛋白酶25mg ，溶解于50ml pH 7.2 的Tris-HCl溶液中；所述的酶溶液Ⅲ配制方法如下：胃蛋白酶30 mg，溶解于30mL 0.01 mol/L的盐酸溶液中；所述的酶溶液Ⅳ配制方法如下：蛋白酶E 80 mg，溶解于80mL的pH 7.4的Tris-HCl溶液中。

3.根据权利要求2所述的一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于：所述的嗜酸乳杆菌与所述的Triton X-100溶液的混合比例为3g：10mL， 所述的嗜酸乳杆菌与所述的酶溶液Ⅰ的比例为3g：8mL，所述的酶溶液Ⅰ、所述的酶溶液Ⅱ、所述的酶溶液Ⅲ与所述的酶溶液Ⅳ的比例为2：2：1：1；所述的甲醇-水中甲醇与水的体积比为2：l； 所述的甲醇-氯仿中甲醇与氯仿的体积比为1:1。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的一种改性嗜酸乳杆菌肽聚糖的制备方法，其特征在于：所述的嗜酸乳杆菌肽聚糖、所述的蒸馏水、所述的四甲基哌啶、所述的NaBr和所述的NaClO的混合比例为200mg：20ml：5mg：48mg：0.3-0.5mmol，所述的乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为7：3。