[发明专利]用于人乳头瘤病毒18基因检测的生物试剂

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域的基因检测技术，尤其涉及用于人乳头瘤病毒18（HPV18）基因检测的生物试剂、其制备方法以及基因的检测方法。

背景技术

人乳头瘤病毒（human papilloma virus,HPV）是一种最小的DNA（脱氧核糖核酸）病毒。HPV呈球形，直径约为45～55nm，具有嗜上皮性，在人和动物中分布广泛。HPV在自然界中广泛存在，人类感染HPV十分普遍，感染率也很高。综合国外一些报道，在自然人群中HPV感染率从低于1％到高达50％，在性活跃人群中20％～80％以上的人有HPV感染史。

HPV病毒在临床上可分为许多的亚型，而不同亚型的病毒可能导致不同的疾病。另外，根据致病力的程度或危险性大小，可将不同的亚型分为低危和高危两大类，其中HPV高危亚型的感染会引起生殖器癌和子宫颈癌上皮细胞病变。人乳头瘤病毒18（HPV18）属于高危亚型，是宫颈癌的重要致病因素。

目前宫颈癌的筛查主要是基于细胞学的检测方法，有宫颈巴氏（Pap）涂片、阴道镜活检、液基薄层细胞学或薄片制备细胞学检查（TCT）等多种。

宫颈巴氏涂片是群体筛查的常规手段，但受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，准确性低，假阳性率高，重复性差，敏感性也有限，漏诊率可达30%。TCT法会引起不适、操作不便、费用高，不易为广大患者接受。宫颈组织活检有创伤，不利于人群普查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有特异性强、灵敏度高的检测试剂盒，用于快速检测人乳头瘤病毒18（HPV18）类型。HPV18检测简单易行，标本可由医生采集或患者自取，是对细胞学检测方法的重要补充。

为实现上述目的，本发明提供了一种用于人乳头瘤病毒18型（HPV18）基因检测的生物试剂、其制备方法以及在基因检测的方法。

一方面，本发明提供了一种用于HPV18基因检测的试剂盒。所述试剂盒的组分包括：引物、探针、Taq聚合酶、10×buffer缓冲液、dNTP、试验标准品、阴性质控品和超纯水。

其中，合成的引物是由包括CPG、四氮唑、乙酸酐和1-甲基咪唑、碘、dNTP的原料合成。根据HPV的不同分型设计不同引物和探针。

另一方面，本发明还提供了用于HPV18基因检测的试剂盒的制备方法，其包括下述步骤：

1）确定待测基因片段：根据科技文献的方向性报道初步选定候选基因片断，然后经研发过程中与待检样本病理相关性的比较，最终确认与临床疾病最具相关性的待测基因片断；

2）根据所述待测基因片段设计并生产引物和探针，采用多核苷酸合成仪生产所述引物；

3）提取细胞基因组DNA：用DNA提取液提取病人基因组及对照组基因组DNA；

4）确定PCR扩增条件，其包括酶、探针、引物、基因组DNA用量及PCR的扩增条件：不同组合的引物片断，根据实验结果的特异性，敏感性等技术特征，反复试验，同时进行多条所述待测基因片断的检测反应，最终确定包括所述引物、探针最佳浓度及酶的最佳反应条件，其中，PCR基因扩增的结果由荧光PCR仪来检测；

5）进行重复性检测以进一步确定反应条件：通过大量实验，反复比较实验结果中包括清晰度和灵敏性的因素，最终确定反应条件；

6）根据最终确定的所述反应条件，制备试剂盒，其组分包括：引物、探针、dNTP、10×buffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。

又一方面，本发明还提供了采用本发明试剂盒进行HPV18基因检测的方法。

采用本发明的试剂盒进行HPV18基因检测，其中所述试剂盒的组分包括：细胞提取液、引物、探针、dNTP、10×buffer缓冲液、Taq聚合酶、试验标准品、阴性质控品和超纯水。

本发明以用基因组提取试剂盒提取的患者的细胞基因组DNA为模板，用试剂盒提供的引物、探针、dNTP、酶、试剂标准品等组分，20μL反应体系，按照特定的比例分别加入，采用PCR基因扩增技术，实现对HPV的基因检测。

具体检测步骤如下：

1）试剂准备：取PCR反应液备用。

2）加样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品(包括标本和阳性质控品)上清液1μl，8,000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。3）程序编辑：按对应顺序设置阴性质控品、以及未知标本（含阳性质控品），并在样本参数中设置样品名称。设置程序后运行。

本发明的技术关键涉及引物和探针的设计、合成和纯化以及细胞提取液的配置和标准品的制备。