[发明专利]一种基于手性四面体构象改变对DNA进行检测的方法

权利要求书

1.一种基于手性四面体构象改变对DNA进行检测的方法，其特征在于：金纳米粒子的合成、金纳米粒子的表面修饰、DNA-金纳米粒子复合物的合成、金纳米粒子四面体的组装、手性四面体的构建以及目标DNA手性传感器的建立；工艺步骤为：

（1）金纳米粒子的合成

柠檬酸和单宁酸两步法合成10nm金纳米粒子；

（2）金纳米粒子的表面修饰

步骤（1）合成的金纳米粒子用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹，使得纳米粒子表面负电荷更多，以提高胶体金在高盐溶液中的稳定性；

（3）DNA-金纳米粒子复合物的合成

步骤（2）制得的表面修饰的金纳米粒子与末端带巯基的DNA按照一定比例混合反应；所用的DNA共有四种：Y1，Y2，Y3，Y4，形成四种不同的Au-DNA复合物：Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4；

（4）金纳米粒子四面体的组装

将步骤（3）合成的四种Au-DNA复合物，等比例混合组装形成金纳米粒子四面体；

（5）手性四面体的构建

步骤（3）所用的四种DNA中，其中Y3中间嵌入了一段含13个碱基的DNA环，所以在步骤（4）组装的金纳米粒子四面体中，其中一个边含有一个DNA 环，当加入与这段DNA环完全互补的序列Y5时，DNA环被打开，四面体中两个粒子之间的距离变大，原本对称的金纳米粒子四面体变成不对称结构，从而使得原本没有手性信号的结构出现手性信号；

（6）目标DNA手性传感器的建立

基于步骤（5）的方法建立目标DNA手性传感器；

Y1：5’-TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CG-3’

Y2：5’- TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG-3’

Y3：5’-TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC TC ATG TCT CAT CT CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC-3’

Y4：5’-TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC-3’

Y5：5’-AG ATG AGA CAT GA GGA CCA GTT CGC C-3’。

2.根据权利要求1所述的基于手性四面体构象改变对DNA进行检测的方法，其特征在于：

（1）金纳米粒子的合成

柠檬酸和单宁酸两步法合成金纳米粒子的方法为：分别取两个洁净的三角瓶，A瓶中加入158mL超纯水和2mL 1%氯金酸；B瓶中加入8mL 1%柠檬酸三钠，0.2mL 1%单宁酸，0.2mL 25mM碳酸钾，31.6mL超纯水；A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，混合液在60℃下继续搅拌40min到形成深红色溶液；最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示平均粒径为10±2nm；

（2）金纳米粒子的表面修饰

步骤（1）合成的10 nm柠檬酸稳定的金纳米粒子取100mL于离心管中，13000r/min浓缩至终浓度为 50nM，加入10μL 20mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡反应10h；用13000r/min离心10min后去除上清液，加超纯水恢复到原体积；

（3）DNA-金纳米粒子复合物的合成

步骤（2）制得的表面修饰的金纳米粒子各取50μL于四个PCR管中，向4个管中依序各自加入1μL 10μM的四种DNA：Y1，Y2，Y3及Y4，混匀后，向各体系中加入5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 1M NaCl溶液，室温振摇反应2h；合成好的Au-DNA复合物用13000r/min 离心10 min，去除上清液，沉淀加1×tris-硼酸缓冲液至原体积，形成四种不同的Au-DNA复合物：Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4；

（4）金纳米粒子四面体的组装

将步骤（3）合成的四种Au-DNA的复合物：Au-Y1，Au-Y2，Au-Y3，Au-Y4，各取50μL混合于1.5mL离心管中，加入5μL 1M NaCl溶液，室温反应过夜，形成对称的金纳米粒子四面体，该结构没有手性信号；

（5）手性四面体的构建

在步骤（4）的制备过程中加入与Y3内嵌的DNA环完全互补的序列Y5，此时Y5会与 Au-Y3中的DNA环互补杂交，使DNA环完全打开，四面体中两个纳米粒子之间的距离拉大，原本对称的金纳米粒子四面体的构象被改变，变成不对称的空间四面体结构，该结构在圆二色谱520nm处表现出明显的特征峰；

（6）目标DNA手性传感器的建立

基于步骤（5）的方法建立目标DNA手性传感器，具体操作为：在步骤（4）的制备过程中加入不同浓度的目标DNA：Y5，根据520nm处圆二色信号的比值与目标DNA的浓度建立标准曲线，DNA的检测限为43aM，线性范围在0.05fM-50fM。